Électrophorèse capillaire : une technique pour analyser les amplicons de réaction en chaîne par polymérase marqués par fluorescence

Résumé

Source : Gulla, S. et al., Analyse en tandem à nombre variable multi-locus de la bactérie pathogène des poissons Yersinia ruckeri par PCR multiplexe et électrophorèse capillaire. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo décrit la technique d’électrophorèse capillaire pour analyser les amplicons PCR marqués par fluorescence obtenus à partir de divers échantillons en fonction de leur taille. Il génère un modèle migratoire qui détermine la longueur de la paire de bases des fragments à l’aide du colorant fluorescent marqué dans chaque fragment.

Protocole

1. Conditions de configuration et de fonctionnement de l’électrophorèse capillaire

1. Après confirmation des amplicons de PCR, diluer les produits de PCR 1:10 (v/v) dans de l’eau purifiée. Scellez, mélangez et centrifugez brièvement.
2. En travaillant dans une sorbonne, préparez un volume de mélange principal composé de 9 μL de formamide et de 0,5 μL de calibre standard par produit PCR (prévoir 10 % de volume excédentaire). Agitez brièvement et distribuez 9,5 μL dans des puits sur une plaque adaptée au système CE disponible avant d’ajouter 0,5 μL de produit PCR dilué. Scellez, mélangez et centrifugez brièvement.
   ATTENTION : Manipuler avec précaution. Le mélange de formamide avec de l’eau génère de l’acide formique, qui est toxique.
3. À l’aide d’un thermocycleur PCR, dénaturez les échantillons à 95 °C pendant 3 min avant de refroidir à 4 °C indéfiniment. Centrifugez brièvement et chargez la plaque sur un système CE calibré conformément aux instructions du fabricant.
4. Effectuer l’analyse de fragments CE à l’aide de réactifs adaptés à l’appareil de son choix et aux réglages suivants : 60 °C ; injections en 5 s à 1,6 kV (32 V par cm) ; autonomie en 32 minutes à 15 kV (300 V par cm). L’analyse de fragments CE de 24 puits sur un capillaire de 24 cm (50 cm) prend généralement environ 50 min.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Analyseur génétique Avant 3500xL	Thermo Fisher Scientific	Réf. A30469	Utilisé pour l’analyse des fragments d’électrophorèse capillaire.
Coloration à l’acide nucléique GelRed, 10 000 fois dans l’eau	Biotium	Réf. 41003	Colorant fluorescent à base d’acide nucléique utilisé lors de l’électrophorèse sur gel.
Logiciel GeneMapper 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	Utilisé pour la lecture d’électrophérographies à partir d’électrophorèse capillaire.
GeneScan 600 LIZ colorant Taille standard v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	Étalon de taille utilisé lors de l’électrophorèse capillaire.
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	Formamide désionisé utilisé lors de l’électrophorèse capillaire. Préparez des aliquouts de travail.
Eau Milli-Q	Na	Na	Eau purifiée utilisée lors de la PCR et de l’électrophorèse capillaire. Recette standard ; Produit en interne.
Polymère POP-7 pour analyseurs génétiques 3500 Dx/3500xL Dx	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	Matrice de séparation utilisée lors de l’électrophorèse capillaire.
Système d’imagerie/visualisation sur gel à base d’UV	Comme vous le souhaitez.	Na
Vortex	Comme vous le souhaitez.	Na