L’électrophorèse alcaline sur gel unicellulaire : une technique sensible pour l’estimation quantitative des dommages à l’ADN dans les cellules cancéreuses individuelles après une chimiothérapie

Résumé

Source : Lu, Y., et al. Évaluation des dommages à l’ADN in vitro à l’aide d’un test de comète J. Vis. Exp. (2017)

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test d’électrophorèse alcaline unicellulaire pour quantifier les cassures d’ADN simple et double brin dans des cellules traitées à la doxorubicine. Les conditions alcalines perturbent les liaisons hydrogène entre les paires de bases d’ADN, ce qui entraîne le déroulement et la séparation complets des brins d’ADN. Cela permet la migration différentielle de fragments d’ADN intacts et endommagés dans un gel d’agarose lors de l’électrophorèse, révélant une structure en forme de comète de migration lente de l’ADN non endommagé formant la tête de comète circulaire, et de migration rapide des fragments d’ADN endommagés formant la queue de comète allongée.

Protocole

1. Préparer les réactifs

1. 1x PBS
   1. Diluez 100 mL 10x PBS avec 900 mL dH₂O et ajustez le pH à 7,4 à l’aide d’un pH-mètre. Conserver à température ambiante.
2. Solution de lyse (LS)
   1. Préparez 2,5 mM de NaCl, 100 mM d’EDTA disodique, 10 mM de base Tris et 200 mM de NaOH dans 900 mL dH₂O ; il faut généralement environ 20 minutes pour permettre au mélange de se dissoudre complètement. Ajustez le pH à 10 à l’aide d’un pH-mètre. Ajouter du laurylsarcosinate de sodium à 1 % et du Triton X-100 à 1 % et ajuster le volume final à 1 000 ml. Laisser refroidir à 4°C pendant au moins 30 min avant utilisation.
3. Solution d’électrophorèse alcaline (AES), pH >13
   1. Préparez 200 mM de NaOH et 1 mM d’EDTA disodique dans 800 mL dH₂O. Ajustez le pH et assurez-vous qu’il est >13. Ajustez le volume final à 1 000 ml. Préparer frais avant utilisation et laisser refroidir à 4°C pendant au moins 30 min avant utilisation
4. Solution de coloration
   1. 1. Ajouter 1 μL de colorant d’acide nucléique fluorescent 10 000x vert (p. ex., SYBR Green) dans 30 mL de tampon Tris-EDTA (10 mM de Tris-HCl, 1 mM d’EDTA disodique, pH 7,4) et conserver à 4 °C. Protéger de la lumière.
5. 1 % d’agarose à bas point de fusion
   1. Faire fondre 1 % d’agarose à bas point de fusion (1 g dans 100 mL dH₂O) au micro-ondes. Faites tourner l’agarose toutes les 15 à 20 s pour vous assurer qu’elle est complètement fondue. Placez l’agarose dans un bain-marie à 37°C pendant au moins 20 min avant utilisation.
6. Préchauffage des pointes de pipette
   1. Coupez les extrémités étroites des pointes de pipette P200 de 3 mm et réchauffez-les à 37°C avant de pipeter l’agarose.

2. Préparer les diapositives Comet

1. Revêtement de glissement
   1. Faire fondre l’agarose à 1 % (1 g dans 100 mL dH₂O) au micro-ondes pendant 2 à 3 minutes ou jusqu’à ce que l’agarose soit complètement fondu. Trempez les lames de microscope en verre dans l’agarose et essuyez un côté de la lame à l’aide d’une lingette non pelucheuse.
   2. Posez les lames sur une surface plane pour les faire sécher à l’air libre ou à la chaleur à 50°C pour un séchage plus rapide ; un film d’agarose transparent doit se former après séchage. Placez les lames revêtues à 37°C avant utilisation.
2. Préparation de suspensions unicellulaires
   1. Cultiver et traiter la cellule de gliome
      1. Cultivez les cellules U251 MG dans un milieu DMEM-Ham F-12 complété par 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 10 μg/mL de streptomycine à 37 °C avec 5 % de CO₂.
      2. Digérez les cellules avec 1 mL de trypsine pendant 3 min et neutralisez la trypsine avec le milieu DMEM-Ham F-12 avec FBS. Prélever dans un tube de 15 ml, faire tourner à 300 x g pendant 4 min, aspirer le milieu et suspendre les cellules à 2 x 10⁵ cellules/mL dans 1x PBS.
         note: L’échantillon de cellule doit être préparé immédiatement avant de commencer le test et tous les échantillons doivent être manipulés dans un environnement sombre ou sombre pour éviter d’endommager l’ADN par la lumière.
      3. Combinez la suspension cellulaire avec de l’agarose fondue à bas point de fusion (à 37 °C) dans un rapport de 1:10 (v/v), mélangez doucement en pipetant de haut en bas, et pipetez immédiatement 30 μL sur une lame recouverte d’agarose. Utilisez le côté de la pointe de la pipette pour étaler le mélange agarose/cellule afin d’assurer la formation d’une fine couche.
      4. Placez la lame à plat à 4°C dans l’obscurité pendant 10 min. L’augmentation du temps de gélification à 30 min améliore l’adhérence des échantillons dans les environnements très humides.
      5. Immergez la lame à 4°C LS dans l’obscurité pendant 1 h à toute la nuit.
3. Électrophorèse à cellule unique
   1. Pour le dosage des comètes alcalines
      1. Retirez délicatement les lames du LS, vidangez l’excédent de tampon et immergez-les doucement dans AES pendant 1 h à 4°C pour permettre le déroulement de l’ADN. Gardez les diapositives dans l’obscurité.
      2. Ajoutez de l’AES pré-réfrigéré dans le plateau de lames d’électrophorèse, ne dépassez pas 0,5 cm au-dessus des lames (cela dépend de la taille des unités d’électrophorèse), placez les lames à l’intérieur et couvrez avec un bouchon. Réglez la tension d’alimentation sur 1 V/cm (la longueur entre les électrodes) et faites fonctionner pendant 30 min à 4°C.
      3. Vidangez l’excès de solution d’électrophorèse de la lame. Immergez doucement les lames deux fois dans dH₂O pendant 5 min chacune à température ambiante.
      4. Immergez doucement les lames dans de l’éthanol à 70 % pendant 5 minutes à température ambiante. Passez à la coloration.
4. Taches Comètes Lames
   1. Lames sèches à 37°C pendant 10 à 15 min dans l’obscurité.
   2. Placer 50 à 100 μL de solution de coloration d’acide nucléique fluorescente verte sur chaque agarose séchée et colorer pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
   3. Rincez brièvement les lames à dH₂O et séchez-les complètement à 37°C dans l’obscurité. Passez à l’acquisition et à l’analyse des images.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10x PBS (sans Ca++, Mg++)	TEKnova	Réf. P0196
NaCl	sigma	S5886
Edta	TEKnova	E0308
Base Trizma	sigma	Réf. T1503
NaOH	sigma	Référence 72068
Lauryl sarcosinate de sodium	sigma	N° L7414
Triton X-100	sigma	Référence 93443
SYBR Vert	Invitrogen	Réf. S33102
Agarose à bas point de fusion	Invitrogen	Référence 16520
Agarose	Invitrogen	N° 16500
95 % éthanol	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
trypsine	GIBCO	Référence 25300-054
Lames de tissu de verre	SCIENCES DE LA MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE	Référence 63422-11
Lingettes Kimwipes	KIMberly-Clark
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL	DENVILLE
Pointes de pipette	tranchant
micro-ondes	Avanti
Bain d’eau	précision
Chambre d’électrophorèse horizontale	TREVIGEN	Cometassay ES II
alimentation	Bio-Rad
incubateur	Laboratoire de Quincy	Modèle 12-140E
Microscope fluorescent	Zeiss	LSM700
Micropipette	Eppendorf