Électrophorèse capillaire microfluidique pour la taille des fragments de produits PCR : une technique de séparation électrophorétique basée sur une micropuce pour séparer les fragments d’ADN en fonction de leur taille

Résumé

Source : Wang, H., Zhu et al. A Robust Polymerase Chain Retest for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit la technique d’électrophorèse capillaire microfluidique permettant de séparer les amplicons de PCR en fonction de leur taille. Cette technique permet de dimensionner les fragments à l’aide de colorants fluorescents et de marqueurs de taille moléculaire standard.

Protocole

1. Dimensionnement des fragments des produits PCR

1. Avant de commencer, laissez le concentré de colorant d’ADN, la matrice de gel d’ADN, le marqueur d’ADN, l’échelle d’ADN et les échantillons d’ADN purifié s’équilibrer à température ambiante pendant 30 min.
2. Configurer la station d’amorçage
   1. Remplacez la seringue (voir le tableau des matériaux) lors de l’utilisation d’un nouveau lot de réactifs.
   2. Ajustez la plaque de base, relâchez le levier du clip de seringue et faites-le glisser vers le haut en position haute.
3. Démarrez le logiciel de dimensionnement (voir Tableau des matériaux) et préparez le mélange gel-colorant.
4. Concentré de colorant vortex pendant 10 s et spin down. Ajouter 25 μL de colorant dans un flacon à matrice de gel. Vortex bien la solution mixte et tournez.
   1. Transférez le mélange gel-colorant dans un filtre d’essorage. Placez le filtre d’essorage dans une microcentrifugeuse et faites-le tourner pendant 10 min à température ambiante à 1 500 x g ± 20 %.
      REMARQUE : Protégez la solution avec un colorant de la lumière et conservez-la à 4 °C après utilisation. Le mélange gel-colorant peut être utilisé pour environ 15 chips une fois préparé. Laissez le mélange gel-colorant s’équilibrer à température ambiante pendant 30 minutes à chaque fois avant de l’utiliser.
5. Charger le mélange gel-colorant
   1. Insérez une nouvelle puce à ADN sur la station d’amorçage. Ajouter 9 μL de mélange gel-colorant dans le puits marqué « G ». Assurez-vous que le piston est positionné à la marque de 1 ml, puis fermez la station d’amorçage.
   2. Appuyez sur le piston de la seringue jusqu’à ce qu’il soit maintenu par le clip. Attendez exactement 30 s puis relâchez le clip. Attendez 5 s, puis rabaissez lentement le piston à la position 1 mL.
   3. Ouvrez la station d’amorçage et ajoutez 9 μL de mélange gel-colorant dans les puits marqués d’un « G ».
6. Ajoutez 5 μL de marqueur dans le puits marqué par le symbole de l’échelle et ajoutez également 5 μL de marqueur dans chacun des 12 puits d’échantillon. Ne laissez aucun puits vide.
7. Ajoutez 1 μL d’échelle d’ADN dans le puits marqué du symbole de l’échelle. Ajouter 1 μL de produit PCR (puits usagés) ou 1 μL d’eau ultrapure (puits non utilisés) dans chacun des 12 puits d’échantillonnage. Placez la puce horizontalement dans l’adaptateur du mélangeur vortex et du vortex pendant 1 min au réglage indiqué (2 400 tr/min).
8. Insérez la puce dans l’instrument de bioanalyseur et faites fonctionner la puce dans l’instrument dans les 5 minutes.
9. Une fois le test terminé, retirez immédiatement la puce usagée de l’instrument.
10. Ajoutez lentement 350 μL d’eau déminéralisée dans l’un des puits du nettoyeur d’électrodes. Ouvrez le couvercle du bioanalyseur et placez-y le nettoyant pour électrodes. Fermez le couvercle et laissez incuber pendant environ 10 secondes. Ouvrez le couvercle et retirez le nettoyant pour électrodes. Attendez encore 10 s pour permettre à l’eau sur les électrodes de s’évaporer, puis fermez le couvercle.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Instrument bio-analyseur Agilent 2100 : tubes PCR de 0,2 mL	Axygen	PCR-02D-C
Instrument bio-analyseur Agilent 2100 : 1x tampon TE, pH 8,0, sans RNASE	Ambion	AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument : 2100 Bioanalyzer instrument	Agilent	G2939AA
Instrument de bioanalyseur Agilent 2100 : plaque PCR à 96 puits	Thermo Fisher	AB0800
Instrument bio-analyseur Agilent 2100 : Cartouche d’électrode	Agilent		Fournit l’équipement de l’instrument 2100 Bioanalyzer
Instrument bio-analyseur Agilent 2100 : mélangeur vortex IKA	Agilent		Fournit l’équipement de l’instrument 2100 Bioanalyzer
Agilent 2100 Bioanalyseur instrument : Logiciel de dimensionnement 2100 Logiciel expert	Agilent		Fournit l’équipement de l’instrument 2100 Bioanalyzer
Instrument bio-analyseur Agilent 2100 : Puces de test	Agilent		Fournit l’équipement de l’instrument 2100 Bioanalyzer
Kit Agilent DNA 7500	Agilent	Référence 5067-1506	Pour le dimensionnement des fragments
Kit Agilent DNA 7500 : Échelle DNA 7500 (capuchon jaune)	Agilent		En kit : Kit Agilent DNA 7500 (numéro de catalogue : 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500 : Marqueurs ADN 7500 (capuchon vert)	Agilent		En kit : Kit Agilent DNA 7500 (numéro de catalogue : 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500 : Puces ADN	Agilent		En kit : Kit Agilent DNA 7500 (numéro de catalogue : 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500 : Concentré de colorant ADN (capuchon bleu)	Agilent		En kit : Kit Agilent DNA 7500 (numéro de catalogue : 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500 : Flacon de matrice de gel d’ADN (capuchon rouge)	Agilent		En kit : Kit Agilent DNA 7500 (numéro de catalogue : 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500 : Nettoyeur d’électrodes	Agilent		En kit : Kit Agilent DNA 7500 (numéro de catalogue : 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500 : Filtre de spinning	Agilent		Fournitures du kit Agilent DNA 7500 (numéro de catalogue : 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500 : Seringue	Agilent		Fournitures du kit Agilent DNA 7500 (numéro de catalogue : 5067-1506)
Station d’amorçage des copeaux	Agilent	Référence 5065-4401	Fournit l’équipement de l’instrument 2100 Bioanalyzer
Collecteur à vide à plaque filtrante : Collecteur à vide MultiScreenHTS	Merck Millipore	MSVMHTS00	Instrument de vide pour le vide de plaque filtrante Collecteur pour la purification de produits PCR
Collecteur de vide à plaque filtrante : Bouchon en silicone	Merck Millipore	XX2004718	Collecteur de vide à plaque filtrante
Collecteur à vide à plaque filtrante : Pompe à vide	Merck Millipore	WP6122050	Collecteur de vide à plaque filtrante
Collecteur de vide à plaque filtrante : Récipient de collecte des déchets	Merck Millipore	XX1004705	Collecteur de vide à plaque filtrante