FDS non réductrice PAGE : Méthode d’analyse des complexes protéiques multimériques liés au disulfure

Résumé

Source : Rotoli, S. M. et al., Combinaison de l’analyse non réductrice SDS-PAGE et de la réticulation chimique pour détecter les complexes multimériques stabilisés par des liaisons disulfures dans les cellules de mammifères en culture. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit la technique de séparation des échantillons de protéines par SDS-PAGE non réducteur pour analyser les complexes protéiques multimériques. Cette technique conserve les sous-unités multimères d’une protéine maintenue par les liaisons disulfure qui peuvent ensuite être analysées par western blot.

Protocole

1. Blocage des résidus de cystéine libre à l’aide de l’iodoacétamide

1. Cultiver des cellules U-2 OS dans une boîte de 6 cm² jusqu’à une confluence de 50 % à 60 % dans un milieu essentiel minimum avec un glucose élevé contenant 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pyruvate de sodium à 37 °C dans 5 % de CO₂.
2. Préparez un nouveau stock de 10 mM d’iodoacétamide juste avant l’utilisation, puis jetez tout réactif non utilisé.
3. Ajouter 0,1 mM de concentration finale d’iodoacétamide directement dans le milieu de culture cellulaire. Secouez doucement le plat à température ambiante pendant 2 min.

2. Récolte des cellules

1. Aspirez les fluides des cellules.
2. Lavez les cellules avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) froide trois fois. Aspirez la solution de lavage finale de PBS, puis ajoutez 1 mL de PBS froid.
3. Grattez les cellules du fond de la boîte à l’aide d’un grattoir à cellules. À l’aide d’une pipette de 1 ml, prélevez le PBS et la suspension cellulaire et distribuez tout le liquide dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
4. Faites tourner les cellules à 7 500 x g pendant trois minutes à 4 °C. Aspirez le PBS en laissant la pastille de cellule derrière vous. La pastille cellulaire peut être stockée à -80 °C jusqu’au traitement

3. Extraction de protéines

1. Préparez 100 μL d’un tampon de lyse 1x dilué dans ddH₂O (voir le tableau des matériaux). Ajouter du fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) immédiatement avant l’utilisation à une concentration finale de 1 mM.
2. Ajouter 50 μL du tampon de lyse 1x directement sur la pastille cellulaire et mettre en suspension. Incuber sur glace pendant 5 min.
3. Sonicate pendant 8 s en utilisant le mode d’impulsion constante à 40 % (voir le tableau des matériaux pour le sonicateur ; ajuster si nécessaire pour différents sonicateurs), en maintenant l’extrait sur de la glace.
4. Essorer l’extrait à 4 °C pendant 5 min à 16 000 x g. Le surnageant est la fraction protéique soluble. Une analyse de Bradford peut être effectuée pour déterminer la concentration en protéines si vous le souhaitez.

4. Préparation des échantillons

1. Prélever 10 μL d’extrait protéique soluble et ajouter 10 μL d’un tampon d’échantillon Laemmli SDS (4 % SDS, 20 % de glycérol, 0,004 % de bleu de bromophénol et 0,125 M de Tris-HCl, pH 6,8). N’ajoutez pas de réactifs réducteurs.
2. Conserver les échantillons sur de la glace si une analyse de la FDS PAGE doit être effectuée ce jour-là ; pour un entreposage à long terme, une température de -20 °C est appropriée. Juste avant d’appliquer le gel, chauffez l’échantillon pendant 5 min à 85 °C.

5. Réticulation in vivo du formaldéhyde de protéines endogènes dans des cellules U-2 OS

1. Cultivez des cellules U-2 OS dans une fiole de² cm jusqu’à une confluence de 70 à 80 %.
2. Effectuer la réaction de réticulation du formaldéhyde
   1. Dans une hotte, aliquote une solution de formaldéhyde à 37 % achetée auprès de sources commerciales. Ajoutez le fixateur de formaldéhyde directement sur le milieu jusqu’à une concentration finale de 1 % et incubez à température ambiante en agitant doucement pendant 15 min.
   2. Pour éteindre la réaction, ajoutez 1,25 M de glycine à une concentration finale de 0,125 M et incubez à température ambiante en agitant doucement sur une bascule pendant 5 min.
3. Lavez les cellules avec 5 ml de PBS froid trois fois. Aspirez la solution de lavage finale de PBS et ajoutez 10 ml de PBS. Grattez les cellules du fond du ballon à l’aide d’un grattoir à cellules.
4. À l’aide d’une pipette de 10 ml, prélevez le PBS et la suspension cellulaire et versez le liquide entier dans un tube à centrifuger conique de 15 ml. Faites tourner les cellules à 500 x g pendant 2 min à 4 °C. Aspirez le PBS en laissant la pastille de cellule derrière vous.

6. Fractionnement des noyaux

1. Préparez 10 mL de tampon d’homogénéisation : 0,25 M de saccharose, 1 mM d’EDTA, 10 mM d’HEPES et 0,5 % de BSA à pH 7,4. Ajouter le PMSF immédiatement avant l’utilisation à une concentration finale de 1 mM et 3 mL de tampon de suspension de noyaux (0,1 % de Triton X-100 dans du PBS).
2. Ajouter 5 mL de tampon d’homogénéisation directement sur la pastille de cellule et suspendre complètement. Centrifuger la suspension à 500 x g pendant 2 min à 4 °C, puis jeter le surnageant.
3. Mettre la pastille en suspension dans 5 mL de tampon d’homogénéisation. À l’aide d’un homogénéisateur en verre téflon bien ajusté, homogénéisez les cellules à 10 coups/500 tr/min.
4. Centrifuger la suspension à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C, puis jeter le surnageant.
   REMARQUE : Utiliser le surnageant pour isoler les mitochondries par centrifugation à 10 000 x g pendant 10 min.
5. Suspendre la pastille dans un tampon de suspension de 1 mL et l’incuber sur de la glace pendant 10 min.
6. Centrifuger à 600 x g pendant 10 min. Jeter le surnageant.
7. Suspendez la pastille dans un tampon de suspension de noyaux de 1 mL et centrifugez-la à nouveau. Jetez le surnageant. La pastille finale sera constituée de noyaux isolés.

7. Extraction des protéines

1. Répétez la section 4, sauf en ajoutant 25 μL du tampon de lyse 1x directement sur la pastille de cellule, puis en suspendant.

8. Préparation des échantillons

1. Préparez deux échantillons pour SDS-PAGE en prélevant 10 μL chacun de l’extrait de protéine soluble et ajoutez 10 μL de 2 tampons d’échantillon SDS Laemmli et 1 μL de 2-Mercaptoéthanol (BME).
2. Chauffer un échantillon pendant 5 min à 37 °C et le second échantillon pendant 15 min à 98 °C pour inverser la réticulation du formaldéhyde.

9. Analyse de la page SDS

1. Préparez 1 L de 1 tampon de tris-glycine (25 mM de Tris, 192 mM de glycine, 0,1 % (p/v) SDS).
2. Configurez la SDS-PAGE en exécutant apparatus.
   REMARQUE : Ce protocole utilise une page SDS TGX préfabriquée à 16 %. Il convient de noter que n’importe quel pourcentage de gel peut être utilisé.
   1. Selon le protocole du fabricant, ouvrez l’emballage dans lequel le gel est stocké et retirez la cassette.
   2. Retirez le peigne qui tapisse les puits et le ruban adhésif du bas de la cassette.
   3. Placez le gel dans l’appareil de course.
   4. Remplissez la chambre avec le tampon 1x jusqu’à ce que les puits soient immergés dans le liquide. À l’aide d’une pipette en plastique, rincez les puits avec le tampon courant.
3. Chargez les échantillons sur le gel avec un marqueur standard précoloré de 10 μL.
4. Faites fonctionner le gel à 200 V jusqu’à ce que la face du colorant soit à environ 1 cm du bas du gel.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
16 % de gels TGX préfabriqués	ThermoFisher	XP00160
Bleu bromophénol
Bsa	Signalisation cellulaire	Référence 99985
Tampon de lyse cellulaire	Signalisation cellulaire	Référence 9803
centrifugeuse	Eppendorf	5415D
DMEM	Gibco	Référence 11330-032
Edta	Sigma Aldrich	M101
Appareil d’électrophorèse	Invitrogen	A25977
Sérum fœtal bovin	Gibco	1932693
Formaldéhyde	ThermoFisher	Référence 28908
Homogénéisateur verre-téflon
glycérol	Sigma Aldrich	Référence 65516
glycine	Rpi	Référence 636050
Hepes	Sigma Aldrich	N° H0527
Iodoacétamide	ThermoFisher	Référence 90034
Pbs	Sigma Aldrich	Réf. P3813
alimentation	Biorad	Référence 200120
Marqueur précoloré	ThermoFisher	Référence 26619
Sds	Biorad	Référence 161-0302
Sonicateur	Branson	450
Base Tris	Rpi	Réf. T60040
Tris Saline tamponnée	Sigma Aldrich	SRE0031	avec Tween 20, pH 7,5
Tampon de course Tris-Glycine	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	Réf. T8787
Système d’exploitation U-2	ATCC	HTB-96