Focalisation isoélectrique en phase liquide : une technique d’électrophorèse pour séparer les molécules bioactives de l’extrait brut de Gymnema sylvestre

Résumé

Source : Veerapandian, R., et al. Séparation de petites molécules bioactives, de peptides de sources naturelles et de protéines de microbes par la méthode de focalisation isoélectrique préparative (IEF). J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo décrit une technique permettant de séparer des molécules complexes d’extraits de plantes à l’aide de la focalisation isoélectrique en phase liquide. Cette technique permet de purifier des biomolécules complexes dans leur état natif, qui peuvent être utilisées pour diverses applications en aval.

Protocole

1. Séparation et purification de petites molécules et de peptides à partir de l’extrait de Gymnema sylvestre

1. Mesurer 0,6 g d’extrait de plante et dissoudre dans de l’eau distillée (60 mL) en mélangeant dans un tube roulant pendant 5 min.
   REMARQUE : Tout échantillon biologique soluble et exempt de sel peut être utilisé pour la séparation et la purification à l’aide d’un instrument de focalisation isoélectrique en phase liquide (IEF). Les échantillons avec une concentration en sel tampon allant jusqu’à 10 mM peuvent être utilisés avec une résolution légèrement réduite.
2. Centrifuger l’extrait végétal solubilisé à 10 000 x g pendant 5 min pour éliminer les particules insolubles.
3. Transférez le surnageant (~60 ml) dans un tube à centrifuger de 80 ml et mélangez-le avec 0,6 ml d’ampholyte (pH 3-10) à 1 % (v/v).
4. Préparez l’unité IEF en phase liquide.
   1. Assemblez les électrodes IEF en phase liquide (bouton anode-rouge et bouton cathode-noir) avec leurs membranes d’échange respectives conformément au manuel d’instructions (Table des matériaux). Équilibrer les membranes échangeuses d’anions avec 0,1 M de NaOH et les membranes échangeuses de cations avec 0,1 M H₃PO₄ au moins pendant 16 h lorsque de nouvelles membranes sont utilisées.
   2. Stockez les membranes dans des électrolytes (0,1 M NaOH ou 0,1 M H₃PO₄) entre les passages et ne les laissez pas sécher.
   3. Assemblez les parties intérieure et extérieure de l’électrode en alignant trois trous oblongs dans les joints échangeurs d’ions. Remplissez les électrodes avec les électrolytes respectifs (~25-30 ml) pour éviter que leurs membranes ne se dessèchent.
   4. N’ajoutez pas d’électrolyte en excès (plus de 1/3 du volume de la chambre de l’électrode) qui pourrait accumuler de la pression à l’intérieur de l’électrode et provoquer des fuites.
   5. Couvrez les orifices de collecte d’échantillons avec du ruban adhésif fourni avec les pièces d’assemblage de l’instrument (table des matériaux). Le côté des orifices de collecte des échantillons est identifiable par les deux goupilles d’alignement verticales en métal. Vous pouvez également utiliser du ruban d’étanchéité standard pour sceller les ports.
   6. Assemblez toutes les pièces de la chambre de focalisation dans l’ordre (électrode d’anode, noyau de membrane en nylon, chambre de mise au point et électrode cathodique) sur le doigt de refroidissement en céramique.
   7. Remplissez la chambre de focalisation avec de l’eau distillée prérefroidie (volume total de 60 ml pour la pile IEF standard) à l’aide d’une seringue de 50 ml.
   8. Connectez l’instrument IEF en phase liquide à une circulation d’eau de refroidissement à 4 ºC et pré-faites fonctionner l’appareil à 15 W et 3 000 V pendant 3 à 5 min ou jusqu’à ce que la tension se stabilise.
      REMARQUE : Généralement, en une minute, la tension atteindra les valeurs de consigne maximales. Le pré-passage avec de l’eau distillée aide à éliminer les ions résiduels de la chambre de focalisation et du noyau de la membrane en nylon.
   9. Coupez la source d’alimentation et retirez l’eau de la cellule à l’aide du collecteur de fractions. Refermez les orifices de collecte avec du ruban adhésif. La chambre est maintenant prête à charger l’échantillon.
5. À l’aide d’une seringue de 50 ml munie d’une aiguille à bout émoussé de 1-1/2 pouce et 19 g (fournie avec l’instrument) et chargez l’échantillon préparé avec de l’ampholyte (60 ml au total) dans la cellule par les orifices de prélèvement d’échantillons.
6. Éliminez les bulles d’air de la cellule d’échantillonnage en retirant la cellule de focalisation du support et en tapotant la chambre de l’électrode pour déloger les bulles. La présence de bulles d’air provoquera des fluctuations de tension et de courant et affectera le fonctionnement.
7. Connectez l’appareil au liquide de refroidissement à eau (4 °C) et démarrez le fractionnement avec l’alimentation électrique à une puissance constante de 15 W.
8. Faites fonctionner l’appareil pendant 3 h ou jusqu’à ce que la tension atteigne une valeur constante.
   REMARQUE : Lorsque l’échantillon commence à se concentrer, la tension commence à augmenter progressivement jusqu’à ce qu’elle atteigne une valeur constante.
9. Après le passage, préparez-vous à collecter les fractions dans la boîte de récolte (contenant 20 tubes en plastique, 12 mm x 75 mm, volume de 5 à 6 ml) connectée à la pompe à vide en appuyant sur le bouton de récolte ON dans l’unité IEF.
10. Alignez les 20 broches de collecte avec les 20 ports de collecte de la cellule de mise au point scellée avec le ruban.
11. Poussez les goupilles de collecte à travers le ruban d’étanchéité et mettez la pompe à vide en marche simultanément (Figure 1B, 1C et 1D).
    REMARQUE : Environ 3 mL de fractions de chaque chambre seront collectées dans les tubes à chaque fois. Les fractions peuvent être utilisées pour des applications ultérieures en aval (SDS-PAGE pour la quantification des peptides, CCM et biodosage pour les petites molécules).

Résultats

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtre à seringue de 0,45 μm	Scientfic de Fisher	Tél. : 09-720-004
Bio-Lyte 3/10 Ampholyte	Bio-Rad	163 à 1113
Bio-Lyte 5/8 Ampholyte	Bio-Rad	Référence 163 à 1192
Thermostat basse température compact	Lauda -Brinkmann	RM 6T	Réglez le refroidissement par eau à 4 °C et il peut fonctionner même à 0 °C car lorsqu’il passe à travers le noyau de refroidissement Rotofor, la température de l’eau en circulation sera d’environ 5 ou plus selon la tension.
Poudre d’extrait de feuille de plante Gymnema (>25 % d’acides gymnémiques)	Suan Farma, NJ États-Unis
Mini électrophorèse protéiforme	Bio-Rad
Ph-mètre	Mettler Toledo	S20	Utile pour déterminer le pH des fractions du Rotofor (IEF en phase liquide)
Rotofor	Bio-Rad	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Mode d’emploi pour le montage de l’appareil)
RPMI-1640 Moyen	HyClone	DH30255.01
Ruban d’étanchéité	Bio-Rad	170-2960	Du ruban adhésif peut également être utilisé
Centrifugeuse Sorvall legend micro 17	Thermo scientifique	75002432