Électrophorèse capillaire d’affinité de décalage de mobilité : une méthode pour analyser les interactions échantillon-ligand en fonction de la migration différentielle de complexes protéine-ligand

Résumé

Source : Nachbar M. et al., Analyse du désordre intrinsèque d’AtHIRD11 et de la liaison vers les ions métalliques par électrophorèse sur gel capillaire et électrophorèse capillaire d’affinité. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit la méthode d’analyse de l’interaction protéine-ligand par électrophorèse capillaire d’affinité de déplacement de mobilité. Cette méthode peut être utilisée pour caractériser le comportement de liaison d’une protéine avec divers ligands chargés.

Protocole

1. Préparer les solutions pour l’analyse ACE

1. Préparez la solution de NaOH 1 M.
   1. Peser 4,0 g de NaOH dans une fiole jaugée de 100 ml.
   2. Remplissez-le jusqu’au trait de jauge avec de l’eau déminéralisée pour faire une crosse de 1 M.
2. Préparez l’acide éthylènediaminetétraacétique 0,1 M (EDTA) dans une solution de NaOH 0,1 M.
   1. Transvaser 10 mL de NaOH 0,1 M dans une fiole jaugée de 100 mL à l’aide d’une pipette à bulbe de 10 mL. Remplissez-le jusqu’à la marque avec de l’eau déminéralisée.
   2. Peser 2,42 g d’EDTA sur un bateau de pesée et dissoudre le composé solide dans 100 mL de NaOH 0,1 M.
3. Préparez la solution tampon Tris (30 mM).
   1. Ajouter 3,63 g de Tris, 200 ml d’eau déminéralisée et une barre d’agitation dans un bécher de 500 ml. Placez le bécher sur une plaque à mélanger et allumez-le.
   2. Placez une électrode de pH-mètre dans le bécher et ajustez le pH à 7,4 à l’aide de 0,1 M HCl.
   3. Remplissez la solution dans une fiole jaugée de 1 L et remplissez jusqu’au trait de jauge avec de l’eau désionisée.
      REMARQUE : Cette procédure doit être répétée ou un ballon jaugé plus grand est nécessaire car plus de 1 L est nécessaire pour l’ensemble de l’analyse.
4. Préparez la solution de marqueur d’écoulement électroosmotique (EOF) d’acétanilide (60 μM).
   1. Ajouter 6 mg d’acétanilide et 100 mL de tampon Tris dans une fiole jaugée de 100 mL.
   2. Placez la fiole jaugée dans un bain à ultrasons et allumez-la pendant 30 min.
5. Préparez la solution d’échantillon (1 mg/mL).
   1. Placez un tube de microcentrifugation de 0,5 ml sur une balance de précision et ajoutez 0,3 mg de poudre d’AtHIRD11 lyophilisée dans le tube.
   2. À l’aide d’une micropipette, ajoutez 0,3 mL d’un tampon Tris de 30 mM (pH 7,4) dans le tube. Secouez soigneusement le tube pour dissoudre la protéine.
6. Préparez les solutions de ligand.
   1. Préparez la solution mère de CaCl₂ (5 mM).
      1. Prenez un bateau de pesée, posez-le sur une balance analytique et pesez 36,76 mg de CaCl₂*H₂O.
      2. À l’aide d’une micropipette, rincer le CaCl₂*H₂O de la cabine de pesée dans une fiole jaugée de 50 mL avec le tampon Tris préalablement préparé.
      3. Remplissez la fiole jaugée avec le tampon Tris jusqu’au repère.
   2. Préparez les solutions mères restantes (5 mM).
      1. Répétez l’étape 1.6.1 en utilisant les autres sels métalliques au lieu de CaCl₂*H₂O [MgCl₂ : 23,80 mg, BaCl₂ : 26,02 mg, Sr(NO₃)₂ : 52,91 mg, MnCl₂ : 31,46 mg, SeCl₄ : 52,91 mg, CoCl₂*2H₂O : 41,47 mg, CuCl₂*2H₂O : 42,62 mg, ZnCl₂ : 3,41 mg et NiCl₂*6H₂O : 59,43 mg].
         note: La solution de ZnCl₂ a une concentration de 0,5 mM. Comme de fortes interactions entre les ions et la paroi capillaire interne ont été observées, la concentration a été réduite d’un facteur 10⁴.
   3. Préparez la solution de CaCl₂ de 500 μM.
      1. Remplissez 10 ml de la solution mère de CaCl₂ et mettez-la dans une fiole jaugée de 100 ml.
      2. Remplissez la fiole jaugée avec un tampon Tris jusqu’à la marque et secouez la fiole.
   4. Préparez la solution de CaCl₂ de 250 μM.
      1. Remplissez 5 mL de la solution mère de CaCl₂ et mettez-la dans une fiole jaugée de 100 mL.
      2. Remplissez la fiole jaugée avec un tampon Tris jusqu’à la marque et secouez la fiole.
   5. Répétez les étapes précédentes pour les autres solutions mères.
7. Remplissez les solutions dans les flacons.
   note: Chaque passage répété nécessite un ensemble de flacons d’entrée et de sortie. L’utilisation de solutions de ligands frais à l’entrée et à la sortie réduit les décalages du temps de migration après chaque passage.
   1. Remplir la solution de CaCl₂ de 250 μM dans une seringue de 10 mL.
   2. Placez un filtre PVDF de 0,22 μm sur la seringue et poussez 2 ml de la solution à travers le filtre à l’aide de la seringue afin de jeter cette solution filtrée.
   3. Remplissez 10 flacons jusqu’au volume maximal autorisé avec les 250 μM restants de la solution de CaCl₂ de la seringue. Marquez chacun comme flacon d’entrée de solution de CaCl₂ de 250 μM.
   4. Remplissez 10 flacons jusqu’à ce qu’ils soient à moitié remplis avec la solution de CaCl₂ de 250 μM. Marquez chacun comme flacon de sortie de solution de CaCl₂ de 250 μM.
   5. Répétez les étapes 1.7.1 à 1.7.4 pour les autres solutions contenant du sel métallique.
   6. Répétez les étapes pour chaque paire de flacons d’entrée et de sortie en utilisant la solution tampon Tris de 30 mM (pH 7,4) à la place.
      note: Le tampon Tris de 30 mmol/L pH 7,4 est utilisé entre les cycles pour obtenir des données sur le temps de migration de la protéine en l’absence d’ions métalliques. Il est nécessaire de négliger les changements dans l’EOF.
   7. Répétez les étapes ci-dessus pour un flacon en utilisant la solution de marqueur EOF d’acétanilide (60 μM) à la place. Répétez également ces étapes en utilisant la solution de l’échantillon (1 mg/mL) à la place.

2. Analyse électrophorétique capillaire d’affinité

1. Conditionner le capillaire
   1. Réglez le thermostat sur 23 °C.
      note: La température est utilisée selon les protocoles publiés et peut être modifiée à d’autres températures. Cependant, les interactions dépendent de la température et changeront en conséquence.
   2. Rincez un capillaire pendant 40 min à 2,5 bar avec 0,1 M de NaOH.
   3. Rincer le capillaire pendant 10 min à 1,0 bar avec de l’eau déminéralisée.
   4. Rincer le capillaire pendant 30 min à 1,0 bar avec un tampon Tris de 30 mM (pH 7,4).
2. Préparation aux méthodes ACE
   1. Préparez la méthode pour les mesures sans ligands.
      note: L’acétanilide n’a pas été ajouté à la solution de l’échantillon, car il dissimule 2 pics de protéines.
      1. Rincer le capillaire pendant 1 min à 2,5 bar avec une solution d’EDTA 0,1 M.
      2. Rincer le capillaire pendant 1 min à 2,5 bar avec de l’eau déminéralisée.
      3. Rincer le capillaire pendant 1,5 min à 2,5 bar avec un tampon Tris pour l’équilibre.
      4. Injecter la solution d’acétanilide pendant 6 s à 0,05 bar et remplacer les flacons d’entrée et de sortie par les flacons tampons Tris.
      5. Appliquer 0,05 bar pendant 2,4 s afin de pousser la solution d’acétanilide de l’extrémité du capillaire plus loin à l’intérieur.
      6. Appliquez 10,0 kV pendant 6 min et détectez le pic d’acétanilide à une longueur d’onde de 200 nm.
      7. Répéter les étapes 2.2.1.1 à 2.2.1.6 en utilisant l’échantillon de protéines au lieu de la solution d’acétanilide et détecter tous les pics de protéines.
   2. Préparez la méthode pour les mesures avec des ligands.
      1. Rincer le capillaire pendant 1 min à 2,5 bar avec une solution d’EDTA 0,1 M.
      2. Rincer le capillaire pendant 1 min à 2,5 bar avec de l’eau déminéralisée.
      3. Rincer le capillaire pendant 1,5 min à 2,5 bar avec la solution de ligand pour l’équilibre.
      4. Injecter la solution d’acétanilide pendant 6 s à 0,05 bar et remplacer les flacons d’entrée et de sortie par des flacons tampons contenant des ligands.
      5. Appliquer 0,05 bar pendant 2,4 s afin de pousser la solution d’acétanilide de l’extrémité du capillaire plus loin à l’intérieur.
      6. Appliquez 10,0 kV pendant 6 min et détectez le pic d’acétanilide à une longueur d’onde de 200 nm.
      7. Répéter les étapes 2.2.2.1 à 2.2.2.6 en utilisant l’échantillon de protéines au lieu de la solution d’acétanilide et détecter tous les pics de protéines.
   3. Répétez alternativement les étapes 2.2.1 et 2.2.2 afin de calculer la variation des rapports charge-taille pour les diverses interactions protéine-ion métal.
      1. Changez la solution protéique toutes les 60 heures pour une solution fraîche.
         note: À ce stade, l’expérience peut être mise en pause. Cette procédure est répétée au moins 10 fois pour chaque concentration de ligands, car le motif des pics varie légèrement d’une course à l’autre. Si la solution est utilisée plus de 60 h, les variations deviennent trop importantes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Exemple AtHIRD11	Université de Shizuoka (Groupe Prof. M. Hara)		Protéine de déshydrine d’Arabidopsis thaliana exprimée dans Escherichia coli
capillaire en silice refusée,	Polymicro Technologies (Phoenix, États-Unis)	Référence 106815-0017	TSP050375 50 μm de diamètre intérieur, 363 μm de diamètre extérieur, revêtement polyimide
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Allemagne)		Instrument d’électrophorèse capillaire ; Agilent 7100 CE peut être utilisé à la place
Pipette à bulbe 25 mL	Duran Group GmbH(Mayence, Allemagne)	Tél. 24 338 14	Préparation de la solution du ligand
Fiole jaugée en verre Duran 25 mL	Duran Group GmbH(Mayence, Allemagne)	Tél. : 24 671 1457	Préparation de la solution mère de ligand
Fiole jaugée en verre Duran 10 mL	Duran Group GmbH(Mayence, Allemagne)	Tél. : 24 671 1054	Préparation de la solution mère de ligand
Acetanilide	Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne)	Référence 397229-5G	Marqueur d’écoulement électroosmotique
Chlorure de manganèse(II)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne)	Référence 13217	ligand
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne)	Réf. 431788-100G	Ingrédient de rinçage
Chlorure de baryum	Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne)	Référence 202738-5G	ligand
Chlorure de nickel(II) hexahydraté	Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne)	Référence 654507-5G	ligand
Chlorure de sélénium(IV)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne)	Référence 323527-10G	ligand
2-amino-2-hydroxyméthylpropane-1.3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne)	Référence 252859-100G	Ingrédient tampon
Chlorure de zinc(II)	Merck Millipore (Darmstadt, Allemagne)	1088160250	ligand
Nitrate de strontium	Merck Millipore (Darmstadt, Allemagne)	1078720250	ligand
Chlorure de calcium dihydraté	Merck Millipore (Darmstadt, Allemagne)	1371015000	ligand
Chlorure de cuivre(II) dihydraté	Riedel-de Haën (Seelze, Allemagne)	Référence 31286	ligand
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03- SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Allemagne)	Référence G2070-91126	Progiciels pour faire fonctionner les instruments CE, acquérir des données et les évaluer