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1. Préparation des échantillons
- Prélever les tissus de l’adénome hypophysaire (0,2 à 0,5 mg) dans le service de neurochirurgie. Congeler immédiatement dans de l’azote liquide, puis transférer à -80 °C pour le stockage.
- Ajouter 2 mL de NaCl à 0,9 % dans de l’eau distillée désionisée (jjH2O). Utilisez cette solution pour laver légèrement le sang de la surface des tissus (3x).
NOTE : le jdH2O avec une conductivité de 18,2 MΩ/cm est utilisé tout au long du protocole. Une partie du tissu peut être perdue lors du lavage du sang de la surface d'un tissu.
- Ajouter un volume (10 mL ; 4 °C) de la solution contenant de l’acide acétique 2 M et du β-mercaptoéthanol à 0,1 % (v/v) pour 0,5 à 0,6 g de tissu, homogénéiser (1 min, 13 000 tr/min, 4 °C, 10x) à l’aide d’un homogénéisateur de tissus, soniser l’homogénat pendant 20 s, lyophiliser et conserver à −80 °C.
- Mesurez la teneur en protéines des échantillons lyophilisés et homogénéisés à l’aide du kit de dosage de l’acide bicinchoninique (BCA).
note: La quantification de l’ACB n’est pas une quantification absolue, et le résultat mesuré sera modifié par un technicien différent et l’agent expérimental. Un étalon d’échantillon à concentration fixe doit être utilisé pour différentes expériences. Par conséquent, la quantité finale de charge de protéines pour chaque gel 2D sera déterminée à l’aide de l’image de bonne résolution colorée à l’argent ou à la Coomassie dans les expériences préconçues.
- Ajouter environ 300 μg de l’échantillon homogénéisé lyophilisé à un volume (282 μL) de tampon d’extraction de protéines (8 M d’urée et 4 % de CHAPS), puis rester debout pendant 2 h, soniser dans un bain-marie pendant 5 min, tourner pendant 1 h, soniser à nouveau dans le bain-marie pendant 5 min, tourner à nouveau pendant 1 h, et centrifugation à 15 000 x g pendant 20 min.
- Préparez des solutions étalons BSA avec les concentrations mentionnées : 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1 500, 2 000 μg/mL avec l’étalon BSA commercial (2 mg/mL).
- Mélanger les réactifs BCA A et B (A :B = 50:1) comme solution de travail BCA avant utilisation.
- Ajouter 0,1 mL de l’échantillon ou de la solution étalon à 2 mL de solution de travail de BCA dans un tube à microfuge, puis mélanger puis incuber à 37 °C pendant 30 min. Enfin, laissez refroidir à température ambiante pendant 10 min et mesurez une valeur de562 nm de diamètre extérieur.
- Calculez la ligne linéaire standard (concentration A562 nm vs. BSA) pour obtenir une équation de régression permettant de calculer la teneur en protéines de l’échantillon avec une valeur A562 nm.
- Utiliser 150 μg de l’échantillon lyophilisé équivalent en protéines pour la coloration à l’argent, ou 500 μg de protéines pour la coloration de Coomassie, pour une bande de gradient de pH immobilisé (IPG) de 18 cm pH 3-10 non linéaire (NL).
note: La bande sèche IPG a une épaisseur de 0,5 mm et une largeur de 3 mm, avec différentes longueurs, notamment 7, 11, 13, 18 et 24 cm, et différentes plages de pH, y compris les pH 4-5, 4-7, 6-9 et 3-10 dans un gradient de pH linéaire ou non linéaire. La mémoire tampon IPG utilisée doit s’adapter à la bande.
- Ajouter 250 μL de tampon d’extraction (7 M d’urée, 2 M de thiourée, 4 % (p/v) de CHAPS, 100 mM de DTT (ajouter avant utilisation), 0,5 % v/v de pharmalyte (ajouter avant utilisation) et une trace de bleu de bromophénol).
- Maintenez la solution à une température inférieure à 30 °C, puis faites un tourbillon pendant 5 min, une sonication pendant 5 min et une rotation pendant 50 min.
- Ajouter 110 μL de tampon de réhydratation (7 M d’urée, 2 M de thiourée, 4 % (p/v) de CHAPS, 60 mM de DTT (ajouter avant utilisation), 0,5 % v/v de tampon IPG (ajouter avant utilisation) et une trace de bleu de bromophénol). Sonicate pendant 5 min. Ensuite, faites pivoter l’échantillon pendant 50 min, agitez le vortex pendant 5 min et centrifugez pendant 20 min à 15 000 x g.
- Prélever le surnageant (350 μL) comme solution d’échantillon de protéines.
2. Électrophorèse sur gel bidimensionnelle
- IEF (Première dimension) : Effectuez l’IEF sur le système de mise au point isoélectrique comme décrit ci-dessous.
- Ajouter 350 μL de la solution d’échantillon de protéines dans la fente d’un support de bandelettes IPG de 18 cm.
- Placez une bande IPG de 18 cm, côté gel, vers le bas, sur la solution d’échantillon de protéines (évitez les bulles).
- Ajouter 3 à 4 ml d’huile minérale pour couvrir la bande IPG.
- Assemblez le support de bande IPG dans le système de mise au point isoélectrique avec l’extrémité pointue sur la plaque arrière (+) et l’extrémité carrée sur la plaque avant (-).
- Réhydrater pendant la nuit (~18 h à température ambiante).
- Réglez les paramètres IEF : courant maximal 30 μA par bande, 20 °C ; 250 V, 1 h, 125 Vh, pas et maintien ; 1 000 V, 1 h, 500 Vh, gradient ; 8 000 V, 1 h, 4 000 Vh, gradient ; 8 000 V, 4 h, 32 000 Vh, pas et maintien ; et 500 V, 0,5 h, 250 Vh, pas et maintien. Laissez-le fonctionner jusqu’à une durée totale de 7,5 h et 36 875 Vh.
- Après l’IEF, retirez chaque bande IPG et retirez l’huile minérale supplémentaire avec une serviette en papier insoluble. Enveloppez maintenant la bande dans une feuille de pellicule plastique et conservez-la à −80 °C.
note: Le support de bande IPG doit être nettoyé avec la solution de nettoyage du support de bande IPG et de l’eau distillée.
- SDS-PAGE (Deuxième dimension) : Effectuer SDS-PAGE dans un système d’électrophorèse à cellules verticales
note: Chaque taille de gel SDS-PAGE doit être de 255 x 190 x 1 mm.
- Utilisez un lanceur multi-gels pour couler des gels résolutifs à 12 % de PAGE. Pour couler des gels PAGE à 12 %, effectuez les opérations suivantes.
- Ajouter 270 mL de ddH2O, 150 mL de Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8), 180 mL de solution mère d'acrylamide/bisacrylamide à 40 % (p/v) (29:1, 40 % p/v d'acrylamide et 1,38 % p/v de N, N'-méthylènebisacrylamide), 3 mL de persulfate d'ammonium à 10 % et 150 μL de TEMED pour préparer la solution gélifiée dans un bécher. Mélangez doucement et évitez les bulles.
- Versez doucement la solution de gel dans la chambre de multicoulée jusqu’à la hauteur de gel prévue (19 cm).
- Ajouter immédiatement environ 3 mL de ddH2O sur chaque gel de résolution pour couvrir les gels. Laissez le gel polymériser pendant environ 1 h.
- Préparez 20 L de tampon d’électrophorèse (25 mM de Tris, 192 mM de glycérine et 0,1 % de SDS). Remplissez le réservoir tampon de l’unité de séparation par électrophorèse avec ce tampon.
- Sortez les bandelettes IPG focalisées du congélateur et équilibrez-les pendant 10 minutes en les balançant doucement dans 4 mL de tampon d’équilibre réducteur (375 mM de Tris-HCl (pH 8,8), 6 M d’urée, 2 % (p/v) de SDS, 20 % (v/v) de glycérol, 2 % p/v de DTT (ajouter avant utilisation) et une trace de bleu de bromophénol).
- Équilibrez pendant 10 minutes en secouant doucement les bandelettes IPG réduites dans un tampon d’équilibre d’alkylation de 4 mL (375 mM de Tris-HCl (pH 8,8), 6 M d’urée, 2 % (p/v) de SDS, 20 % (v/v) de glycérol, 2,5 % p/v d’iodoacétamide (ajouter avant l’utilisation) et une trace de bleu de bromophénol).
- Pendant l’équilibre du gel, démontez la chambre de multidiffusion et retirez la cassette de gel de résolution préparée. Rincer 3 fois avec du ddH2O. Retirer l’excès de ddH2O avec une serviette en papier insoluble et mettre dans un support de gel.
- Rincez les bandes IPG équilibrées avec un tampon d’électrophorèse et éliminez l’excès de liquide sur la surface de la bande IPG avec l’essuie-tout insoluble.
- Placez une bande IPG sur le gel SDS-PAGE de résolution et laissez le côté en plastique de la bande IPG entrer en contact avec la plaque de verre plus longue et l'extrémité pointue à gauche.
- Versez rapidement 3 à 4 ml d’agarose chaude à 1 % dans un tampon d’électrophorèse SDS (~80 °C) pour sceller la bande IPG sur le dessus de chaque gel SDS-PAGE, et placez la face supérieure de la bande IPG sur le dessus de la plaque de verre plus courte sans bulles, puis polymérisez pendant 10 min.
- Insérez la cassette de gel assemblée verticalement entre les joints en plastique dans le système d’électrophorèse vertical. Placez le haut du gel avec la bande IPG à côté de la cathode (-).
- Ajustez le niveau du tampon d’électrophorèse pour immerger la cassette de gel.
- Connectez et réglez l’unité d’alimentation/commande en mode tension constante et faites fonctionner à 200 V pendant environ 370 min tout en surveillant le colorant.
- Après avoir couru, retirez la cassette de gel du système d’électrophorèse et retirez délicatement le gel de la cassette de gel, en évitant de déchirer le gel, suivi d’une coloration des protéines séparées par 2DE.