Électrophorèse sur gel zymographique : une technique électrophorétique pour détecter les métalloprotéinases matricielles en évaluant l’activité enzymatique

Résumé

Source : Hu, X. et al., Détection des métalloprotéinases matricielles fonctionnelles par zymographie. J. Vis. Exp. (2010)

Cette vidéo démontre la technique d’électrophorèse sur gel de zymographie pour évaluer l’activité des métalloprotéinases matricielles (MMP) présentes dans le surnageant de culture cellulaire. Les MMP actifs dégradent le substrat spécifique du MMP incorporé dans un gel de polyacrylamide, qui apparaît sous forme de bandes transparentes sur un fond sombre coloré après la coloration.

Protocole

1. Chargement et fonctionnement du gel

1. Tous les échantillons doivent être préparés adéquatement pour maintenir la fonction des enzymes et utilisés immédiatement après le prélèvement ou conservés congelés à -80 °C. Les échantillons ne doivent pas contenir d’agents réducteurs (tels que le β-mercaptoéthanol) ni être bouillis avant le chargement en gel.
2. Ouvrez le sachet contenant un gel à l’intérieur d’une cassette, rincez la cassette à l’eau déminéralisée.
   1. Retirez le ruban de protection du bas de la cassette et le peigne du haut du gel.
   2. Rincez les puits trois fois avec un tampon courant (dilué à 1X dans de l’eau déminéralisée).
   3. Placez le gel dans la Mini-Cell, en vous assurant que le plus petit côté de la cassette est tourné vers l’intérieur. Verrouillez en place avec la cale de tension en gel. La Mini-Cell permet de faire fonctionner un ou deux gels en parallèle.
   4. Remplissez la chambre supérieure (à l’intérieur) avec 1X tampon courant au-dessus du niveau des puits, vérifiez s’il y a des fuites. En cas de fuites, retirez le tampon et repositionnez le gel.
   5. Remplissez la chambre inférieure avec 1X tampon de fonctionnement.
3. Chargez 10 μL de marqueur moléculaire protéique dans un puits.
   1. Mélangez une quantité égale de tampon de chargement de gel et d’échantillon et chargez dans les puits du gel à l’aide d’embouts de chargement de gel (changés entre chaque échantillon). Ces puits peuvent être chargés avec jusqu’à 20 μL au total.
4. Placez le couvercle sur la Mini-Cell et connectez les cordons d’électrodes à l’alimentation électrique. Allumez l’alimentation et réglez-la pour qu’elle fonctionne à 125 V constant pendant 90 minutes. Vérifiez la formation de petites bulles sur le fil de la chambre inférieure, indiquant la circulation du courant.
5. Lors de l’exécution de votre premier gel, surveillez la progression de la migration toutes les 15 minutes, en utilisant le bleu de bromophénol inclus dans le tampon de chargement comme indicateur. Laissez couler le gel jusqu’à ce que le colorant indicateur atteigne le bas du gel.

2. Renaturation et développement du gel

1. Pour chaque gel, préparez 100 mL de tampon de renaturation 1X et 200 mL de tampon de dénaturation, tous deux dans de l’eau déminéralisée.
2. Lorsque le colorant de suivi bleu de bromophénol atteint le bas du gel, coupez l’alimentation, ouvrez la Mini-Cell et retirez le gel. Séparez les deux côtés de la cassette à l’aide du couteau à gel (ou d’une spatule de pesée). Coupez un coin pour marquer la direction du gel.
3. Retirez délicatement le gel de la cassette et placez-le dans un récipient contenant 100 ml de tampon renaturant. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante avec une agitation douce.
4. Retirez le tampon renaturant et ajoutez 100 ml de tampon de développement au gel. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante avec une agitation douce.
5. Retirez le tampon de développement et ajoutez 100 ml de tampon de développement au gel. Incuber toute la nuit (16-18 heures) à 37°C.
6. Retirez le tampon en développement et rincez trois fois (5 minutes chacune) avec de l’eau déminéralisée en agitant doucement à température ambiante.
7. Scannez le gel pour enregistrer le positionnement exact des bandes étalons de protéines car elles deviendront moins ou pas visibles après la coloration du gel.
8. Teignez le gel en ajoutant 20 ml de SimplyBlue Safestain au gel. Incuber pendant 1 heure à température ambiante sous une légère agitation.
9. Retirez la teinture SimplyBlue Safe et détachez le gel dans 100 ml ou plus d’eau désionisée pendant une heure à température ambiante en agitant doucement.
10. Pour de meilleurs résultats, remplacez-le par de l’eau fraîche déminéralisée et incubez pendant une heure ou plus à température ambiante sous une légère agitation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Appareil d’électrophorèse Xcell SureLock Mini-Cell Marquage CE	Invitrogen	EI0001
Alimentation électrique (modèle 302)	VWR	Référence 93000-744
Gels zymogrammes à 10 % de gélatine Novex, 1,0 mm, 12 puits	Invitrogen	EC61752BOX
Tampon de chargement de gel Blue Juice	Invitrogen	10816015
Conseils de chargement du gel	VWR	Référence 53509-015
Étalon de poids moléculaire des protéines	Invitrogen	LC5800
Tampon de fonctionnement Novex Tris-Glycine-SDS	Invitrogen	Réf. LC2675
Tampon de renaturation du zymogramme Novex	Invitrogen	LC2670
Tampon de développement de zymogramme Novex	Invitrogen	Réf. LC2671
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	Réf. LC6060