Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Préparation de microsphères conjuguées à l’antigène
- Sélectionnez trois flacons différents de microsphères magnétiques avec des régions de billes uniques, en enregistrant l’ID de la perle et les informations de lot pour chaque flacon utilisé.
note: Les étapes suivantes seront suivies pour chaque région distincte de la microsphère. Les microsphères sont sensibles à la lumière et doivent être protégées d’une exposition prolongée à la lumière. Pendant les étapes de lavage, veillez à ne pas déranger les microsphères. En cas de dérangement, laissez une deuxième séparation de 60 secondes.
- Vortex le stock de microsphères pendant 60 s et sonicate pendant 5 min avant de l’utiliser pour dissocier les billes agrégées.
- Transférez 1,0 x 106 billes dans des tubes de microcentrifugation à faible teneur en protéines de 1,5 ml.
- Insérez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation se produire pendant 60 s. Avec le tube toujours dans le séparateur magnétique, retirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille de bille.
- Retirez le tube du séparateur magnétique, remettez les billes en suspension avec 100 μL d’eau de qualité HPLC et agitez pendant 30 s. Remettez le tube dans le séparateur magnétique pendant 60 s, puis retirez le surnageant. Répétez ce protocole de lavage deux fois.
- Retirer le tube du séparateur magnétique et remettre en suspension les microsphères lavées dans 90 μL de phosphate de sodium monobasique de 100 mM, pH 6,2 (tampon d’activation) par vortex pendant 30 s.
- Ajouter 10 μL de Sulfo-NHS à 50 mg/mL (dilué avec un tampon d’activation) dans les microsphères et agiter doucement pendant 10 s. Ajouter 10 μL de solution EDC à 50 mg/mL (diluée avec un tampon d’activation) et agiter doucement pendant 10 s. Incuber les microsphères pendant 20 min à température ambiante (RT) avec un léger vortex toutes les 10 min.
- Répétez les étapes de lavage 1,4-1,5 avec 50 mM MES, pH 5,0 (tampon de couplage) au lieu d’eau de qualité LC/MS pour un total de deux lavages.
- Retirer le tube du séparateur magnétique et remettre en suspension les billes avec 100 μL de tampon de couplage par vortex pendant 30 s suivi immédiatement de l’ajout de la quantité souhaitée de protéines.
- Portez le volume total à 150 μL avec le tampon de couplage. Mélange de réaction de couplage par vortex pendant 30 s et incubation pendant 2 h par rotation à RT.
note: Pour les dosages définis dans le présent document, des conjugaisons ont été effectuées avec les concentrations protéiques suivantes : Spike S1 : 5 μg ; Nucléocapside : 5 μg ; Membrane : 12,5 μg.
- Répétez l’étape de lavage 1.4 avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)-1 % d’albumine sérique de chèvre, 0,01 % de polysorbate-20 (tampon de trempe) au lieu d’une eau de qualité LC/MS pour un total de deux lavages. Remettre en suspension les microsphères lavées dans 100 μL de tampon de trempe contenant 0,05 % d’azoture de sodium par vortex pendant 30 s.
note: Laissez les billes s’éteindre complètement pendant au moins 6 h avant de procéder à toute autre procédure.
- Comptez le nombre de microsphères récupérées à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre. Noter la concentration de billes observée.
- Réfrigérer les microsphères couplées à 4 °C dans l’obscurité.
2. Procédures
- Performances du test (protocole de base)
- Remettre en suspension les microsphères couplées par vortex pendant 30 s et sonicate pendant ~60-90 s.
- Prélever la quantité requise de chaque colloïde de billes du tube respectif et combiner les colloïdes de billes dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
- Insérez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation se produire pendant 60 secondes. Avec le tube toujours dans le séparateur magnétique, retirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille de bille.
- Retirez les billes du séparateur, mettez-les en suspension avec 100 μL d’albumine sérique bovine PBS-1 %, de polysorbate-20 à 0,01 % (tampon de dosage) et un vortex pendant 30 s. Placez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation se produire pendant 60 s. Répétez ce protocole de lavage (c.-à-d. étapes 2.1.3-2.1.4) deux fois.
- Ajustez la concentration du mélange de microsphères de travail 3-plex en ajoutant un volume approprié de tampon de dosage pour générer une concentration finale de 100 microsphères par 1 μL pour chaque cible.
- Aliquote 12,5 μL du mélange de microsphères préparé à l’étape 2.1.5 dans chaque puits d’une plaque de 384 puits ou 25 μL dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.
- Diluez les échantillons de plasma/sérum 500 fois dans le tampon de dosage. Préparer les éprouvettes étalons en fonction du titrage souhaité.
- Ajouter 12,5 μL de tampon d’essai comme échantillon blanc et ajouter chacun des échantillons ou étalons dilués dans chaque puits désigné d’une plaque d’échantillon de 384 puits ou 25 μL de l’échantillon ou de l’étalon dilué blanc dans chaque puits d’une plaque d’échantillon de 96 puits.
- Recouvrez la plaque d’un joint ou d’une feuille d’aluminium et incubez pendant 1 h à RT sur un agitateur de plaque réglé à 700 tr/min.
note: Le schéma des courbes de dilution est fourni dans le tableau 1.
- Préparer une solution d’anticorps de détection antihumaine (solutions d’anticorps secondaires) à 4 μg/mL avec un tampon de dosage, comme indiqué à l’étape 2.1.11.
- Préparez des anticorps IgM anti-humains de chèvre, conjugués avec des anticorps IgA super brillants 436 (SB)/IgA anti-humains et phycoérythrine (PE) à 4 μg/mL ; ou des anticorps IgM anti-humains de chèvre, conjugués SB/IgG anti-humains de chèvre, des anticorps conjugués PE à 4 μg/mL.
note: Pour une plaque à 384 puits, 12,5 μL/puits de la solution d’anticorps secondaire préparée sont nécessaires, et pour une plaque à 96 puits, 25 μL/puits sont nécessaires.
- Placez la plaque sur un séparateur magnétique, lavez-la rapidement et retournez-la avec force sur un récipient à risque biologique pour éliminer le liquide des puits. Avec la plaque toujours inversée, tapotez avec force la plaque contre une épaisse liasse de papier.
- Lavez chaque puits avec 100 μL de tampon de dosage et retirez le liquide par inversion forcée au-dessus d’un récipient à risque biologique, comme décrit précédemment. Répétez ces étapes (2.1.12-2.1.13) pour un total de deux lavages. Jetez toutes les liasses de papier usagées dans un contenant à risque biologique.
- Ajouter 12,5 μL de la solution de travail de l’anticorps secondaire dans chaque puits d’une plaque de 384 puits ou 25 μL dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Recouvrez la plaque d’un joint ou d’une feuille d’aluminium et incubez pendant 30 min à RT sur un agitateur de plaque réglé à 700 tr/min.
- Répétez les étapes de lavage 2.1.12-2.1.13.
- Ajoutez 75 μL de tampon d’essai dans chaque puits d’une plaque de 384 puits ou 100 μL dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Recouvrez la plaque d’un joint en aluminium ou d’une feuille d’aluminium et incubez pendant 5 min à RT sur un agitateur à plaque réglé à 700 tr/min.
- Analysez 60 μL via l’analyseur d’instrument conformément au manuel du système.
Tableau 1 : Séries de dilution pour les courbes standard : Tableau des facteurs de dilution utilisés pour les courbes standard pour le sérotype IgG ; présenté sous la forme d’une courbe de dilution en série à 7 points, 1:5, commençant à 1 μg/mL pour le α-Spike S1 et la α-Nucléocapside et à 5 μg/mL pour les anticorps à α-membrane.
| Numéro standard | Série de dilution | Anti-Spike S1 ou N (μg/mL) | Anti-membrane (μg/mL) |
| blanc | blanc | - | - |
| 1 | STD7 1:1 | 1 | 5 |
| deux | STD6 1:5 | 0,2 | 1 |
| 3 | STD5 1:25 | 0,04 | 0,2 |
| 4 | STD4 1:125 | 0,008 | 0,04 |
| 5 | STD3 1:625 | 0,0016 | 0,008 |
| 6 | STD2 1:3125 | 0,00032 | 0,0016 |
| 7 | STD1 1:15625 | 0,000064 | 0,00032 |
