Dosage de l’activité de la phospholipase : un dosage de la diffusion sur gel pour déterminer l’activité de la phospholipase dans l’extrait de venin brut d’Anthopleura dowii

Résumé

Source : Ramírez-Carreto, S., et al., Identification de l’activité hémolytique et phospholipase dans des extraits bruts d’anémones de mer par des essais biologiques simples. J. Vis. Exp. (2022)

Dans cette vidéo, nous montrons un test permettant d’établir la présence de phospholipase dans l’extrait de venin brut d’Anthopleura dowii, une anémone de mer marine. Le test utilise une technique de diffusion sur gel d’agarose, dans laquelle l’enzyme phospholipase diffuse et décompose les phospholipides incorporés dans le milieu solide de manière radiale.

Protocole

1. Collection d’organismes

1. Collecter l’anémone de mer A. dowii.
   REMARQUE : Ici, les organismes ont été collectés pendant les périodes de marée basse dans la zone intertidale au large de la côte d’Ensenada Baja, en Californie, au Mexique (figures 1A, B). 
2. Transporter les organismes au laboratoire dans des conteneurs remplis d’eau de mer (figure 1C).
3. En laboratoire, nettoyez les organismes avec de l’eau distillée à la main pour éliminer les grosses particules de substrat adhérant au corps.
4. Congelez immédiatement les organismes à -80 °C dans un ultra-congélateur pendant 72 h.
5. Placez les organismes dans des verres spéciaux pour la lyophilisation, avec des conditions de lyophilisation de -20 °C, 0,015 psi, pendant 48 h.
6. Conservez les organismes lyophilisés à -20 °C jusqu’à utilisation.

2. Hydratation des tissus

1. Reconstituer 20 g de poids sec d’organismes lyophilisés avec 60 mL (1/3 p/v) de tampon de phosphate de sodium 50 mM, pH 7,5 et 1 comprimé cocktail inhibiteur (tableau des matériaux).
2. Dans un agitateur magnétique, agiter continuellement l’échantillon à ~800 tr/min, 4 °C, pendant 12 h.

3. Libération de toxines

1. Pour induire la lyse cellulaire et la décharge du nématocyste, congelez l’échantillon à -20 °C pendant 12 h, puis placez le récipient dans de l’eau à température ambiante (RT) jusqu’à ce qu’il décongèle jusqu’à 90 %. Répétez cette procédure trois fois.
   note: L’échantillon ne décongèle pas à 100 % ; il est crucial de maintenir l’échantillon à ~4 °C pour éviter la dégradation des protéines.
2. Observez le nématocyste déchargé au microscope confocal. Prélever 10 μL de l’échantillon sur une lame et placer une lamelle sur celle-ci. Observez au microscope confocal à un grossissement de 100x et 60x. Ici, un colorant n’était pas nécessaire.
3. Traiter les images capturées dans le microscope confocal dans le logiciel ImageJ (version 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, États-Unis, https://imagej.nih.gov/ij).
4. Si le tubule à l’intérieur du nématocyste se déroule et se trouve à l’extérieur, les nématocystes sont évacués ; ensuite, passez à l’étape suivante. Sinon, n’effectuez qu’un seul cycle de gel-dégel supplémentaire.
5. Pour clarifier l’extrait, centrifugez l’échantillon à 25 400 x g pendant 40 min, 4 °C, récupérez le surnageant et centrifugez-le à nouveau. Répétez cette étape 3 à 4 fois.
6. Récupérez le surnageant et jetez la pastille. L’extrait surnageant ou brut contient les composants du venin (toxines) et d’autres molécules cellulaires, telles que les lipides, les glucides et les acides nucléiques.

4. Quantification des protéines totales

1. Déterminez la concentration en protéines de l’extrait brut à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique commercial Bradford (Table des matériaux).
2. Diluez le réactif du colorant (une partie de colorant avec quatre parties d’eau distillée).
3. Préparer une solution d’albumine sérique bovine (BSA) de fraction V (table des matériaux) à une concentration de 1 mg/mL dans un tampon phosphate (50 mM de phosphate de sodium, pH 7,5).
4. Préparez les solutions énumérées dans le tableau 1 en trois exemplaires.
5. Mélangez vigoureusement chaque solution dans un shaker pendant 4 s.
6. Incuber les échantillons pendant 5 min à RT, sans agiter.
7. Mesurez l’absorbance (UA) à 595 nm.
8. Tracer les moyennes des absorbances BSA de l’échantillon (UA en fonction de la concentration en protéines) et déterminer l’équation du graphique (équation 1).
   5. Déterminer la complexité du venin polypeptidique
   1. Assemblez le récipient en verre pour l’électrophorèse verticale sur gel conformément au manuel.
   2. Préparez un mélange d’acrylamide (30 %) : 29,2 g d’acrylamide, 0,8 g de bis-acrylamide, le volume final de 100 mL. Filtrer la solution à l’aide d’une membrane de 0,45 μm. Conservez la solution dans un flacon sombre à 4 °C. Ensuite, préparez le mélange pour le gel de résolution (Tableau 2).
   3. Le gel SDS-PAGE se compose d’un gel de résolution et d’un gel d’empilement. Préparez les gels selon les volumes de solution définis dans le tableau 2. Pendant la préparation, assurez-vous de maintenir chaque mélange à 4 °C pour réduire le temps de polymérisation.
      note: Le volume de chaque mélange varie en fonction de la marque de l’équipement utilisé ; pour ce protocole, les volumes correspondent à la préparation d’un gel d’acrylamide à 15 %, d’une épaisseur de 0,75 mm, pour une chambre d’électrophorèse verticale (Table des matériaux).
   4. Une fois l’acrylamide polymérisé, ~10 min, ajoutez le mélange de gel d’empilement.
   5. Préparez le mélange pour l’empilage du gel, ajoutez-le immédiatement aux plaques de verre et placez un peigne pour former les puits pour le chargement des échantillons.
   6. Une fois que le gel d’empilage a polymérisé (~15 min), retirez le peigne et placez le récipient en verre dans une chambre d’électrophorèse verticale.
   7. Placez 200 mL de tampon d’électrode (0,25 M Tris, 0,192 M de glycine, 0,1 % SDS) dans la chambre d’électrophorèse.
   8. Analysez l’extrait brut : Mélangez 30 μg d’extrait brut avec 5 μL de tampon de charge protéique (25 % de glycérol, 15 % de dodécylsulfate de sodium, 25 % de 2-mercaptoéthanol, 0,125 mM de Tris pH 7, de bleu de bromophénol 0,1 mg/mL) pour dénaturer les protéines. Le volume final doit être de <50 μL.
   9. Chauffer à 90 °C pendant 5 min, refroidir et centrifuger pendant 3 s à 1 400 x g. 10. Chargez les échantillons dans les puits du gel d’empilage. Chargez une échelle de poids moléculaire standard.
   10. Chargez les échantillons dans les puits du gel d’empilement. Chargez une échelle de poids moléculaire standard.
   11. Électrophorèse à 25 mA constant pendant 1 h 30 min.
   12. Retirez les récipients en verre de la chambre d’électrophorèse pour procéder à la coloration des protéines du gel.

   6. Coloration des protéines

   1. Rincez le gel dans 50 ml d’eau distillée pour enlever les débris de l’électrode tampon.
   2. Jetez l’eau.
   3. Pour éviter la diffusion des protéines du gel, ajoutez la solution de fixation (60 ml d’éthanol, 20 ml d’acide acétique et 20 ml d’eau distillée, volume final 100 ml). Incuber à RT pendant 40 min avec secouage à 80 tr/min. Décantez la solution.
   4. Ajouter la solution de réticulation protéique (15 mL d’éthanol, 0,25 mL de glutaraldéhyde, 50 mL d’eau distillée, volume final 65,25 mL) et incuber pendant 30 min à RT en agitant à 80 tr/min. Retirez la solution.
   5. Lavez le gel avec 100 ml d’eau distillée pendant 5 minutes et retirez l’eau. Répétez cette procédure quatre fois.
   6. Effectuer la coloration des protéines avec 50 mL de solution filtrée Coomassie brilliant blue R-250 (40 % de méthanol, 10 % d’acide acétique, 50 % d’eau distillée, 0,1 % de colorant, volume final 100 mL), en agitant à 60 tr/min dans un oscillateur rotatif de laboratoire à RT pendant 15 min.
   7. Récupérez la solution, qui peut être utilisée pour colorer d’autres gels.
   8. Pour éliminer l’excès de colorant, ajoutez une solution de décoloration (40 ml de méthanol, 10 ml d’acide acétique, 50 ml d’eau distillée). Continuez à remuer (80 tr/min) à RT jusqu’à ce que les bandes (protéines colorées) soient visualisées.
   9. Conservez le gel dans 50 ml d’eau distillée et numérisez l’image dans un système de documentation sur gel.

   7. Dosage de la phospholipase

   1. Lavez un œuf de poule avec 1 % SDS dans de l’eau distillée.
   2. Séparez le jaune d’œuf du blanc d’œuf dans des conditions stériles.
   3. Préparez 50 mL de solution de NaCl à 0,86 % et filtrez à travers un filtre de 0,22 μm. Ensuite, préparez la solution A : Ajouter 12 ml de jaune d’œuf et 36 ml de solution de NaCl à 0,86 %.
   4. Préparez la solution B : Mélangez 300 mg d’agarose dans 50 mL de tampon (50 mM de Tris, pH 7,5), filtrez à travers un filtre de 0,22 μm. Faites chauffer la solution au micro-ondes jusqu’à ébullition. Refroidir dans de l’eau tiède pour atteindre 43-45°C.
   5. Préparez la solution C : Préparez 10 mM de CaCl2 et filtrez-le avec un filtre de 0,22 μm.
   6. Préparez la solution D : 10 mg de rhodamine 6G dans 1 mL d’eau distillée.
   7. Dans des conditions stériles (hotte à flux laminaire), ajouter 500 μL des solutions A et C à la solution B et 100 μL de la solution D, mélanger et verser 25 μL dans chaque boîte de Pétri (90 x 15 mm).
   8. Attendre que la solution se solidifie dans des conditions stériles (30 min).
   9. Faites des puits (~2-3 mm de diamètre) avec un tube mince.
   10. Ajouter un total de 20 μL de tampon phosphate (témoin négatif) dans un puits et 20 μL d’une phospholipase déterminée (témoin positif) dans un autre puits.
   11. Placez différentes quantités de protéines d’extrait brut, 5, 15, 25, 35, 45 μg, dans les puits restants, chacun dans un volume final de 20 μL.
   12. Attendre que la gélose adsorbe tous les échantillons (30 min).
   13. Incuber à 37 °C pendant 20 h.
   14. Si un halo se forme autour du puits, cela indique une activité de la phospholipase. Mesurez le halo formé à l’aide d’un pied à coulisse.
       note: Effectuez l’expérience en trois exemplaires (étapes de 7.1 à 7.14).

Résultats

Figure 1 : Collection d’anémones de mer. a) Zone intertidale à El Sauzal, Basse-Californie du Nord, Mexique. (B) Anémone de mer collectée. (C) Anthopleura dowii Verrill, 1869.

Tableau 1 : Quantification des protéines par le test de Bradford.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à centrifuger conique de 15 mL	Corning	430766
Bleu de 2-bromophénol	sigma	Réf. B75808
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Tubes à centrifuger coniques de 50 mL	Corning	430828
Acide acétique glacial	J.T. Baker	Référence 9515-03
acrylamide	Promega	Réf. V3115
Agarose	Promega	Réf. V3125
Le bisacrylamide	Promega	Réf. V3143
Albumine sérique bovine fraction V	sigma	A3059-100G
Dosages des protéines Bradford	Bio-Rad	5000006
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	Réf. C3306
Plaques de culture cellulaire 96 puits, fond en V	Corning	Référence 3894
centrifugeuse	Eppendorf	Référence 5804R
Tubes à centrifuger	Corning	CLS430829
Système ChemiDoc MP	Bio-Rad	1708280
acide citrique	Sigma-Aldrich	251275
Plaques transparentes à fond plat à 96 puits	Thermo Scientific	Référence 3855
Coomassie Bleu Brillant G-250	Bio-Rad	#1610406
Coomassie bleu brillant R-250	Bio-Rad	Référence 1610400
dextrose	J.T. Baker	1916-01
Boîtier sans conduit	Labconco	vertical	https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZ	Biographie Rad.		Système de documentation sur gel
glycérol	Sigma-Aldrich	Référence G5516-4L
Hémocytomètre	Marienfeld	Référence 650030
ImageJ (logiciel)	NIH, États-Unis	Version 1.53c
Incubateur 211	Labnet	I5211 DS
méthanol	J.T. Baker	Référence 9049-03
Tétracellule mini-PROTÉANAISE	Bio-Rad	1658000EDU
Na2HPO4	J.T. Baker	Référence 3824-01
NaCl	J.T. Baker	Référence 3624-01
NaH2PO4.H2O	J.T. Baker	Référence 3818-05
Logiciel Origin		version 9	Pour concevoir le graphique avec des ajustements sigmoïdaux
Pétridure	Faucon	351007
Kit Pipetman	Gilson	F167380
Mini gel préfabriqué	BioRad	1658004
Échelle de protéines précolorées	Thermo Scientific	Référence 26620
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Roche	11836153001
Concentré de réactif de colorant pour dosage de protéines	Bio-Rad	5000006
Rhodamine 6G	Sigma-Aldrich	252433
Sds	Sigma-Aldrich	L4509
Citrate de sodium dihydraté	JT Baker	Référence 3646-01
spectrophotomètre	THERMO SCIENTIFIQUE	G10S UV-VIS
Base Tris	Sigma-Aldrich	Référence 77-86-1
Alimentation en volts	Hoefer	PS300B