1. Fabrication de tampons en polydiméthylsiloxane (PDMS)
- Dessinez un ensemble d’anneaux à l’échelle microscopique à l’aide d’un logiciel de CAO, d’un diamètre intérieur de 250 μm et d’un diamètre extérieur de 450 μm. Le motif utilisé dans ce protocole est un réseau de 10 x 10 avec une distance de 850 μm entre les anneaux.
- Imprimez un masque transparent du motif à la résolution souhaitée en utilisant le service d'impression de masque d'une entreprise de microfabrication (voir Tableau des matériaux).
note: Il a été prouvé que les dimensions fournies de l’anneau fonctionnent pour de nombreux types de cellules.
- Effectuez une photolithographie ultraviolette (UV) à l’aide du masque contenant les caractéristiques souhaitées pour créer un moule photosensible négatif (tel que SU-8).
- Recouvrez une plaquette de silicium recouverte d’une résine photosensible par le masque de transparence fabriqué aux étapes 1.1 et 1.2.
- Sur un aligneur de contact UV, polymériser la résine photosensible sous les régions transparentes du masque par la lumière UV.
note: Après un lavage et un développement supplémentaires, le moule maître avec les caractéristiques souhaitées est fabriqué. Les détails de fonctionnement dépendent de l’équipement spécifique utilisé.
- Préparez des prépolymères élastomères PDMS en les mélangeant avec son agent de durcissement dans un rapport de 10:1, puis coulez le mélange sur le moule dans une boîte de Pétri.
- Placez le plat dans une chambre à vide pendant 30 min pour éliminer les bulles d’air dans le PDMS et faites cuire au four à 60 °C pendant au moins 2 h.
- Après le durcissement complet du PDMS, découpez les tableaux de motifs en stamps.
note: Les tampons plus épais (environ 1 cm) peuvent être préférés en raison de la facilité de manipulation lors des étapes ultérieures de l’impression par microcontact.
2. Revêtement des lames de verre
- Nettoyez les lames de verre. Faites tremper les lames dans un bain 100 % éthanol, sonicate pendant 5 min, puis rincez à l’eau.
- Répétez cette étape d’abord avec de l’acétone, puis avec de l’isopropanol, puis séchez-le dans un courant d’azote.
- Utilisez un équipement d’évaporation par faisceau d’électrons (E-beam) pour revêtir des couches de titane et d’or sur des lames de verre.
note: Pour la couche de titane, l’épaisseur souhaitée est de 15 Å (1 Å = 10-10 m). Pour la couche d’or, l’épaisseur souhaitée est de 150 Å. Enduire d’abord le titane, puis l’or, car la couche de titane sert d’adhésif entre l’or et la lame de verre.
- Placez les lames nettoyées dans la chambre d’évaporation et insérez des creusets en or et en titane sous les volets.
- Pompez la chambre pour créer un vide inférieur à 10-5 Pa avant de faire fondre les métaux. Focalisez le faisceau d’électrons sur le métal et ajustez la puissance de manière à ce que le taux de dépôt soit approprié pour contrôler l’épaisseur du dépôt.
- Ouvrez l’obturateur pour démarrer le dépôt de métal. Fermez l’obturateur lorsque l’épaisseur souhaitée est atteinte.
- Commutez les creusets entre l’évaporation séquentielle de deux métaux.
- Attendez que les creusets refroidissent comme l’exige l’équipement, ventilez la chambre et retirez les lames en verre recouvert d’or.
- Pompez à nouveau la chambre pour l’entretien de l’équipement.
note: Les détails de fonctionnement peuvent dépendre d’un évaporateur à faisceau d’électrons spécifique. Il est important d’avoir un taux de dépôt de titane faible et bien contrôlé. Une épaisse couche de titane entraîne souvent une mauvaise visibilité, en particulier pour l’imagerie par fluorescence des cellules. Après revêtement, les lames de verre revêtues de titane/or peuvent être stockées dans une chambre à vide sèche à température ambiante pendant au moins 1 mois.
3. Impression par microcontact
- Coupez la lame recouverte de titane/or en petits morceaux, si vous le souhaitez. Une forme carrée de 12 mm x 12 mm est recommandée pour une application typique (Figure 1B).
- Utilisez un coupe-verre pour glisser sur la surface pour laisser une piste cabossée, puis tenez la glissière de verre des deux côtés et pliez-la au niveau de la bosse pour la casser en petits quartiers. Évitez de toucher la surface recouverte d’or.
note: Pour déterminer visuellement de quel côté du verre se trouve la surface revêtue en cas de renversement accidentel, comparez la réflexion de la lumière des deux côtés. La surface recouverte d’or montrera un reflet plus brillant, tandis que le côté non revêtu aura une réflexion plus faible (à cause de la couche de titane de l’autre côté du verre). Une autre méthode consiste à observer les bords de la glissière, et le côté du revêtement peut être déterminé à partir de la surface de coupe verticale.
- Nettoyez les lames en les trempant dans de l’éthanol à 100 % dans une boîte de Pétri avec le côté doré vers le haut sur un agitateur orbital pendant au moins 10 min. Aspirez l’éthanol, puis séchez chaque lame en soufflant avec un jet d’azote.
- Nettoyez les tampons PDMS avec de l’eau savonneuse puis de l’éthanol à 100 %. Séchez les timbres avec de l’azote gazeux.
- Préparez une solution d’octadécanéthiol (C18) de 2 mM en dissolvant 5,74 mg de poudre de C18 dans 10 mL d’éthanol à 100 %.
note: Sceller et conserver la solution de C18 à température ambiante. L’impression de motifs avec du C18 crée une monocouche adhésive auto-assemblée pour laquelle la fibronectine et les cellules se fixeront préférentiellement.
- Faites tremper les tampons PDMS dans une solution C18 avec la surface à motifs vers le bas pendant 10 s et séchez doucement avec de l’azote gazeux pendant 60 s.
note: Lors du séchage, éloignez d’abord le jet du tampon (environ 1 m) jusqu’à ce que la majeure partie du liquide se soit évaporée, puis rapprochez lentement le jet pour sécher complètement le tampon. Ceci afin d’éviter que la solution C18 ne soit emportée par le vent au lieu de sécher sur le timbre.
- Posez le tampon face cachée sur les lames dorées pendant 60 secondes avant de le retirer.
- Pour assurer un estampage correct, tapotez doucement la pince à épiler sur les tampons pour transférer correctement les motifs. N’appuyez pas trop fort et le poids de la pince à épiler est généralement suffisant.
note: L’inspection visuelle du tampon pendant le taraudage garantira que le tampon et la lame de verre ont été en contact uniformément.
- Préparez des chambres d’humidité.
- Pipeter 1 mL d’éthanol à 70 % dans un couvercle de boîte de Pétri inversé et déposer un morceau de parafilm pour couvrir la surface (recouvert face vers le haut).
- Utilisez une pince à épiler pour soulever, posez le parafilm pour éviter les bulles d’air et retirez l’excès d’éthanol si nécessaire.
- Préparer une solution de 2 mM de HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) : Diluer 5 μL de solution mère dans 5 mL d’éthanol à 100 %.
note: La solution d’EG3 diluée peut être scellée et stockée à 4 °C, et la solution EG3 non diluée doit être conservée à -20 °C. Le traitement EG3 est utilisé pour rendre la région du verre sans C18 non adhésive aux cellules.
- Des gouttelettes de 40 μL d’EG3 pour chaque quart de verre glissent sur le parafilm dans la chambre d’humidité, en laissant suffisamment d’espace entre les gouttelettes pour tenir compte de l’espacement des lames d’or.
- À l’aide d’une pince à épiler, placez les lames dorées imprimées C18 face vers le bas sur les gouttelettes et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sous les lames. Poussez doucement les lames ensemble sans les soulever pour minimiser l’évaporation.
note: Placez un bord du verre glisse vers le bas près de la gouttelette, puis abaissez lentement l’autre extrémité du verre glisse vers le bas. Si une bulle est présente, poussez la glissière dorée sans la soulever jusqu’à ce que la bulle ne soit plus présente.
- Fermez hermétiquement la boîte de Pétri avec du parafilm et laissez-la à température ambiante pendant au moins 3 h
note: Si une incubation prolongée est souhaitée, fermez deux fois la boîte de Pétri et laissez-la jusqu’à 24 h.
- Dans une enceinte de biosécurité, placez les lames d’or face vers le haut dans une boîte de Pétri, trempez-les et rincez-les 3 fois dans de l’éthanol à 70 % pour éliminer l’EG3, puis laissez-les pénétrer dans l’éthanol pendant 10 minutes pour la stérilisation.
- Aspirez l’éthanol et remplacez-le par du PBS stérile.
- Préparez une autre chambre d’humidité comme décrit à l’étape 3.9, avec du PBS au lieu de l’éthanol.
note: En raison de la différence de tension superficielle, il est plus facile d’ajouter d’abord 4 à 5 ml de PBS pour déposer le parafilm et éliminer les bulles, puis d’aspirer l’excédent.
- Préparez la solution de fibronectine de 50 μg/mL (autres protéines, si désiré) dans du PBS stérile et une micropipette 50 μL de gouttelettes de solution de fibronectine pour chaque quart de glisser sur le parafilm, en laissant un peu d’espace entre les gouttelettes.
note: Le revêtement à base de fibronectine facilite l’adhésion cellulaire aux surfaces à motifs.
- À l’aide d’une pince à épiler, placez les lames face vers le bas sur les gouttelettes et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sous les lames. Poussez doucement les glissières ensemble sans les soulever.
note: Pour la manipulation des diapositives, il est recommandé d’utiliser une pince à épiler en verre ou une pince à gaufrette à pointes droites et larges.
- Laissez la boîte de Pétri dans l’enceinte de biosécurité pendant 30 min.
- Après 30 min, placez les lames dorées face vers le haut dans du PBS après avoir rincé 3 fois.
note: Les lames à motif de fibronectine peuvent être stockées dans du PBS à 4 °C pendant environ un mois.
4. Semis de cellules sur des lames à micromotifs
- Réchauffez le milieu de culture cellulaire et la trypsine dans un bain-marie à 37 °C.
note: La description suivante de la sous-culture concerne les cellules NIH/3T3. Les conditions de culture peuvent varier selon le type de cellule.
- (Facultatif) Faites tremper les lames à motifs dans un milieu de culture dans une plaque à 12 puits, réchauffez-les à 37 °C dans un incubateur avant de trypsiniser les cellules pour une meilleure fixation des cellules.
- Trypsiniser les cellules, neutraliser avec un milieu contenant du FBS, centrifuger à 100 x g pendant 3 min, puis remettre en suspension en mélangeant bien avec un milieu frais.
note: Assurez-vous que les cellules sont complètement dissociées les unes des autres.
- Comptez les cellules, diluez à 200 000 cellules/mL et ajoutez 0,5 mL de suspension cellulaire dans chaque puits contenant une lame d’or.
- Secouez doucement la plaque du puits plusieurs fois pour un ensemencement cellulaire uniforme et conservez-la dans un incubateur pendant 15 minutes pour permettre la fixation des cellules.
- Après 15 min, vérifiez la fixation de la cellule au microscope. Prévoyez plus de temps, si nécessaire.
note: Les cellules attachées s’étaleront à la surface avec un filopodium visible ou un aplatissement et ne bougeront pas de la surface lorsque la plaque du puits est doucement tapotée ou déplacée.
- Aspirer le milieu contenant les cellules non attachées de chaque puits et ajouter 1 mL de milieu de culture. Pour un traitement médicamenteux, ajoutez des réactifs supplémentaires aux milieux de culture à cette étape.
- Cultivez les cellules dans l’incubateur pendant 24 h et vérifiez la confluence pour déterminer si une chiralité s’est formée.
note: Une confluence supérieure à 75 % est recommandée pour la plupart des types de cellules, et une confluence excessive peut affecter la caractérisation de la chiralité.
5. Collection d’images
- Fixez les cellules lors de la confluence.
- Retirer le milieu de culture de la plaque de puits et rincer une fois avec du PBS.
- Ajouter une solution de paraformaldéhyde à 4 %, incuber à température ambiante pendant 15 min, puis rincer 3 fois avec PBS.
REMARQUE : Si la fixation modifie considérablement la morphologie cellulaire, une imagerie avant fixation est recommandée
- Utilisez un microscope à contraste de phase avec fonction de caméra, imagez chaque anneau sur les lames à haute résolution (une lentille d’objet 10x est suffisante pour l’analyse).
6. Caractérisation de la chiralité cellulaire (Figure 2)
- Téléchargez des fichiers de code MATLAB pour la caractérisation de la chiralité.
- Ajoutez le dossier de code et les sous-dossiers (avec la boîte à outils de statistiques circulaires à l’intérieur) au chemin d’accès MATLAB et ouvrez le fichier « ROI_selection.m ». À la ligne 4, remplacez le répertoire par le dossier de données souhaité (pour les utilisateurs de fenêtres, remplacez « / » par « \ » aux lignes 4 et 5).
- Modifiez la taille de l’image à la ligne 14, les deux premiers chiffres représentant la taille du cercle intérieur de l’anneau tandis que les deux autres représentant la taille du cercle extérieur.
note: Assurez-vous que la taille de toutes les images d’un dossier à analyser est identique.
- Cliquez sur le bouton Run pour exécuter le code MATLAB « ROI_selection.m » afin de déterminer la région d’intérêt (ROI) dans les images en contraste de phase.
- Faites glisser manuellement le carré de sélection pour l’adapter à l’anneau, puis double-cliquez sur l’image pour confirmer la sélection.
- Répétez cette étape pour chaque image du dossier (l’image suivante apparaîtra automatiquement après confirmation de la sélection du retour sur investissement d’une image précédente) ; un fichier « .mat » sera généré pour stocker les informations sur le retour sur investissement de chaque image.
- Ouvrez le fichier « Analysis_batch.m » et changez le répertoire du dossier de la même manière qu’à l’étape 6.2. (Pour les utilisateurs de fenêtres, pour la première utilisation, remplacez « / » par « \ » aux lignes 5, 6, 124 et 130)
- Cliquez sur le bouton Exécuter pour exécuter le code « Analysis_batch.m » afin de déterminer la chiralité de plusieurs modèles d’anneaux cellulaires. Un fichier « datatoexcel.txt » sera généré, contenant des statistiques circulaires pour chaque anneau ainsi que les numéros des anneaux dans le sens des aiguilles d’une montre, non chiraux et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
