Dosage de l’absorption des vésicules extracellulaires : méthode de visualisation et de quantification de l’absorption cellulaire des vésicules extracellulaires à l’aide d’une technique d’imagerie par fluorescence 3D

Abstract

Source : Kim, C. J., et al., Essai d’absorption des vésicules extracellulaires via l’analyse d’imagerie au microscope confocal. J. Vis. Exp. (2022).

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test permettant de visualiser et de quantifier l’absorption cellulaire de vésicules extracellulaires ou VE. Ce test utilise l’imagerie fluorescente 3D à l’aide d’un microscope confocal et permet de distinguer les VE internalisés de ceux collés à la surface de la cellule.

Protocol

1. Isolement des VE et marquage immunofluorescent des VE sur puce

1. Collecte de milieux de culture cellulaire (CCM) et prétraitement de CCM pour l’isolement des VE
   1. Ensemencez des cellules PC3 à 30 % de confluence dans une fiole de culture de 2 cellules de⁷⁵ cm. Laisser les cellules témoins croître jusqu’à 90 % de confluence (~48 h) dans des milieux standard et des suppléments spécifiques à la lignée cellulaire.
      note: Pour éviter que les composants contenant des VE n’affectent l’absorption cellulaire (c’est-à-dire le sérum de veau fœtal), utilisez des milieux et des suppléments appauvris en exosomes.
   2. Récoltez le CCM.
   3. Centrifugez le CCM à 1000 x g pendant 10 min à température ambiante (RT) pour granuler les cellules non attachées et les gros débris récoltés avec le média. Transférez le surnageant dans un nouveau tube conique.
   4. Dans le nouveau tube, centrifugez le surnageant à 10 000 x g pendant 20 min à 4 °C pour granuler les petits débris et les corps apoptotiques restant dans le milieu. Certains véhicules électriques plus gros vont granuler. Transférez le surnageant dans un nouveau tube.
   5. Filtrez le surnageant à travers un filtre à seringue à membrane hydrophile en polyfluorure de vinyle (PVDF) de 0,45 μm.
      note: Si vous ne traitez pas immédiatement le CCM pour l’isolation EV, stockez le CCM prétraité à -80 °C jusqu’à ce que l’isolation soit effectuée. S’il est congelé, limitez les cycles de gel-dégel à un seul.
2. Isolation des VE à partir de CCM à l’aide d’un dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration
   1. S’ils sont congelés, décongeler complètement le CCM et le vortex pendant 30 s avant l’étape 1.2.2.
   2. Injecter 1 mL de CCM prétraité (étape 1.1) dans la chambre d’échantillonnage du dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration (voir le tableau des matériaux).
      note: Suivez la procédure d’utilisation standard pour le dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration.
   3. Tourner à 3000 tr/min pendant 10 min dans la machine à filer de paillasse (voir Tableau des matériaux) pour faire fonctionner le dispositif microfluidique.
      note: Si le CCM reste sur la chambre d’échantillonnage après le passage initial, effectuez des rotations supplémentaires jusqu’à ce que tout le CCM se soit vidé de la chambre d’échantillonnage.
   4. Retirez le fluide de la chambre de décharge par pipetage et répétez deux fois les étapes 1.2.1, 1.2.2 et 1.2.3.3.
      note: Au total, 3 mL de CCM seront traités pour l’isolement des VE.
   5. Injectez 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans la chambre d’échantillonnage pour laver les VE isolés. Faites tourner la machine à filer de paillasse pour faire fonctionner le dispositif microfluidique comme mentionné à l’étape 1.2.3. Localisez les VE purs sur la membrane de l’appareil.
      note: La qualité des VE isolés à partir du dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration, en particulier, a été confirmée et comparée à la méthode conventionnelle de CU par microscopie électronique à transmission (MET), microscope électronique à balayage (MEB), analyse de suivi des nanoparticules (NTA), microscopie à éclairage structuré, dosage immuno-enzymatique et PCR en temps réel dans les recherches précédentes.
3. Marquage immunofluorescent des VE à l’aide d’un dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration (Figure 1)
   1. Sélectionnez un anticorps spécifique de l’EV en fonction de l’objectif du test (voir la Table des matériaux).
      note: Certains anticorps peuvent interférer avec les sites de liaison des ligands spécifiques aux voies d’absorption des VE (c.-à-d. l’endocytose).
   2. Injectez 1 μg/mL de l’anticorps spécifique des VE dans le trou d’élution du dispositif contenant 100 μL de VE isolés.
   3. Incuber pendant 1 h dans l’obscurité à RT sur une plaque vibrante pour assurer une répartition uniforme de l’anticorps sur l’échantillon.
   4. Fixez un ruban adhésif sur le trou d’élution. Injectez 1 mL de PBS dans la chambre de l’échantillon pour éliminer tous les anticorps résiduels.
   5. Faites tourner l’appareil à 3000 tr/min jusqu’à ce que la chambre d’échantillonnage soit vide. Retirez tout liquide de la chambre de décharge par pipetage. Injecter 1 mL de PBS dans la chambre d’échantillonnage.
      note: Les VE marqués par fluorescence seront situés dans la chambre à membrane.
   6. Pipetez les VE marqués par fluorescence (Figure 2) de la chambre à membrane vers un tube ambré. Bloquer la lumière jusqu’à utilisation.

2. Incubation des cellules avec des VE marquées par fluorescence pour le test d’absorption des VE

1. Ciblez l’ensemencement et la culture cellulaires sur les boîtes compatibles avec la culture cellulaire.
   1. Semez 1 x 10 cellules 4 PC3 dans la plaque microlame à 8 puits (9,4 x 10,7 mm pour chaque puits) avec 0,2 mL de milieu ou 4 x 10 cellules 4 PC3 dans une boîte de 35 mm avec 1 mL de milieu. Placez les cellules dans une boîte compatible avec la culture cellulaire composée d’une lamelle mince (épaisseur : 0,18 mm).
      note: La lamelle mince minimise la diffusion négative de la lumière.
   2. Laisser les cellules adhérer toute la nuit dans des conditions optimales de culture cellulaire (37 °C, 5 % de concentration en CO₂, 90 % d’humidité).
   3. Laver les cellules collées deux fois avec un milieu appauvri en exosomes (décrit à l’étape 1.1.1).
2. Incubation cellulaire avec des VE marqués par fluorescence.
   1. Mesurer la concentration de VE marqués par fluorescence (étape 1.3.5) par analyse de suivi des nanoparticules (NTA, Figure 3). Déterminer la concentration optimale de VE marquées par fluorescence à ajouter aux cellules en culture (étape 2.1.2.).
   2. Diluer les VE marquées par fluorescence avec un milieu appauvri en exosomes pour correspondre à la concentration souhaitée mesurée à l’étape 2.2.1. (c.-à-d. 7,80 x 10⁹ IL (en valeur NTA) dans 200 μL de milieu appauvri en exosomes.)
   3. Ajouter les VE diluées (étape 2.2.2) aux cellules cibles collées préparées en 2.1.2. Incuber pendant une période expérimentale (c.-à-d. 4, 8 ou 12 h).
   4. Lavez les cellules trois fois avec des milieux sans exosomes pour éliminer tous les VE non internalisés.
      note: En option : les cellules peuvent être fixées après le lavage.
   5. Étiqueter le cytoplasme des cellules collées avec 1 μg/mL de CMTMR ((5-(et-6)-(((4-chlorométhyl)benzoyl)amino) tétraméthylrhodamine) (voir le tableau des matériaux) et incuber dans des conditions optimales de culture cellulaire (37 °C, concentration de 5 % de CO₂, 90 % d’humidité).
      note: Les colorants de surface cellulaire doivent être fluorescents séparément des VE marqués pour aider à déterminer l’emplacement spatial (internalisé ou superficiel) des VE enrichis pendant le test d’absorption des VE.
   6. Lavez deux fois les cellules marquées avec un média appauvri en exosomes pour éliminer le colorant résiduel. Ajoutez des milieux frais appauvris en exosomes aux cellules en préparation de l’imagerie confocale de cellules vivantes.

3. Microscopie confocale

1. Pour effectuer l’imagerie de cellules vivantes, utilisez un incubateur sur scène pour maintenir des conditions de culture cellulaire optimales (37 °C, 5 % de concentration de CO₂, 90 % d’humidité).
2. Placez les cellules préparées dans l’incubateur sur scène.
3. Définissez les paramètres d’imagerie en fonction des échantillons de contrôle.
   note: Les échantillons de contrôle suggérés comprennent : les VE marqués par fluorescence uniquement, les cellules marquées par fluorescence, les VE non étiquetées et les cellules non marquées.
4. Déterminez la profondeur des cellules cibles et la plage de taille d’empilement dans la direction z pour acquérir des images confocales 3D.
   note: L’épaisseur d’une pile Z est de 1 μm. L’acquisition d’images 3D confocales a duré 2 min 34 s (chaque acquisition d’image dans le plan Z a duré environ 8 s ; un total de vingt images Z-stack).
5. Réglez l’acquisition d’images sur plusieurs images empilées z de colorant spécifique à la cellule (c’est-à-dire rouge) et de colorant spécifique à EV (c’est-à-dire vert) simultanément (Figure 4 et Figure 5A).

4. Traitement d’images

1. Utilisez un logiciel de traitement automatique d’images pour analyser les images confocales brutes empilées en z et déterminer l’absorption de l’EV par les cellules (voir le tableau des matériaux).
2. Réglez les paramètres de seuillage sur le signal fluorescent des cellules et des colorants spécifiques aux VE. Construisez les surfaces virtuelles des cellules (Figure 5A,B).
   1. Pour construire les surfaces virtuelles des cellules, cliquez sur le bouton Ajouter de nouvelles surfaces.
   2. Sélectionnez Calcul de la distance la plus courte comme « Paramètres de l’algorithme » pour utiliser l’algorithme fourni par le logiciel, puis cliquez sur Suivant : Canal source.
   3. Sélectionnez Canal 2 - CMTMR comme « Canal source » dans cette expérience.
   4. Sélectionnez Lisser et entrez la valeur appropriée dans « Détail des surfaces » pour le lissage de surface.
      REMARQUE : 0,57 μm dans cette expérience car 1 pixel représente 0,57 μm dans les données d’imagerie brutes.
   5. Sélectionnez Intensité absolue comme « Seuillage ».
   6. Pour seuiller automatiquement l’image fluorescente à l’aide de l’algorithme fourni, cliquez sur Seuil (intensité absolue) : la valeur est automatiquement définie.
   7. Sélectionnez Activer en tant que « Diviser les objets en contact (croissance de la région) » et entrez la valeur de la taille de cellule estimée dans « Diamètre des points d’amorçage », 10,0 μm dans cette expérience. Cliquez ensuite sur Suivant : Filtrer les points de départ.
   8. Pour configurer les surfaces de cellules virtuelles, cliquez sur le bouton + Ajouter, puis sélectionnez Qualité comme « Type de filtre ». Fixez le seuil à la valeur appropriée (210 dans cette expérience) pour la limite inférieure par une inspection visuelle et la valeur maximale (1485) pour la limite supérieure, puis cliquez sur le bouton Terminer.
      note: Une inspection visuelle signifie qu’un chercheur peut distinguer la zone cellulaire d’une image fluorescente brute.
   9. Ensuite, pour construire les points virtuels des VE, cliquez sur le bouton Ajouter de nouveaux Spots.
   10. Sélectionnez Différentes tailles de spot (région en croissance) et Calcul de la distance la plus courte comme « Paramètres de l’algorithme », puis cliquez sur Suivant : Canal source.
   11. Sélectionnez le canal 1 - Alexa Fluor 488 comme « Canal source » dans cette expérience.
   12. Mettez la valeur appropriée dans « Diamètre XY estimé » pour la détection ponctuelle, 1 μm dans cette expérience. Cliquez ensuite sur Suivant : Filtrer les points.
   13. Pour configurer les points EV virtuels, cliquez sur le bouton + Ajouter, sélectionnez Qualité comme « Type de filtre » et définissez « Seuil inférieur » par une inspection visuelle, 100 dans cette expérience. Cliquez ensuite sur le bouton Suivant : Type de région Spot.
   14. Sélectionnez Intensité absolue comme « Type de régions ponctuelles », puis cliquez sur Suivant : Régions ponctuelles.
   15. Pour atteindre le seuil, la région des points EV, mettez la valeur appropriée dans « Seuil de région » par une inspection visuelle, 100 comme « Seuil de région » dans cette expérience.
       note: Une inspection visuelle signifie qu’un chercheur peut distinguer la zone des VE d’une image fluorescente brute.
   16. Sélectionnez Volume de la région comme « Diamètre à partir de », puis cliquez sur Terminer.
3. Utilisez les algorithmes fournis par le logiciel pour diviser les points groupés à l'intérieur de la surface construite à l'étape 4.2 (Figure 5C, i-iv).
   1. Cliquez sur les spots intégrés, puis allez dans Filtres.
   2. Cliquez sur le bouton + Ajouter, puis sélectionnez Distance la plus courte par rapport aux surfaces Surfaces = Surface 1 comme type de filtre, puis cliquez sur le bouton Dupliquer la sélection vers les nouveaux points. Le seuil le plus bas (-7,0 dans cette expérience) pour la limite inférieure et la valeur appropriée (-0,5) pour la limite supérieure.
      note: Définissez la limite supérieure avec le rayon estimé des Spots. Dans cette expérience, le diamètre estimé des taches, c’est-à-dire des points EV, a été fixé à 1 μm à l’étape 4.2.11. Ainsi, la limite supérieure peut être de 0,5.
4. Comptage automatique des VE à l’intérieur des cellules
   note: Le logiciel comptera automatiquement le nombre de VE à l’intérieur des cellules, indiquant le nombre internalisé par les cellules cibles.
   1. Cliquez sur l’option Spots 1 (Distance la plus courte par rapport aux surfaces = Surfaces 1 entre -7,00 et -0,500).
   2. Allez dans les Statistiques, et exportez la valeur de « Nombre total de places"
      note: Les algorithmes fournis par le logiciel calculeront automatiquement le nombre et le volume des cellules.
5. Déterminer le rendement de l’absorption de VE par période d’incubation en fonction des valeurs calculées ci-dessus (figure 6).
   1. Pour obtenir le nombre de cellules, cliquez sur l’icône Surfaces 1 construite, puis allez dans les Statistiques, et exportez la valeur de « Nombre total de surfaces » à partir de Global.
   2. Allez dans Détaillé dans les statistiques pour exporter le volume de Détaillé.

Results

Figure 1 : Illustration schématique de l’isolement des VE et de l’étiquetage sur puce à l’aide d’un dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration. (A) Isolation des VE à partir du CCM. (B) Marquage immunofluorescent sur puce des VE. (C) Élimination des anticorps non liés.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anticorps anti-humain CD63	Biolégende	353038	Anticorps spécifique de l’EV conjugué à un colorant fluorescent
CellTracker Orange CMTMR Colorant	Thermo Fisher Scientific	Réf. C2927	Réactif de marquage fluorescent de cellules vivantes (cytoplasme)
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Objectif pour l’imagerie confocale, NA = 1,25
CFI Plan Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Objectif pour l’imagerie confocale, NA = 0,75
Exodisque	Labspinner Inc.	EX-D1001	Un dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration pour l’isolation des VE
ExoDécouverte	Labspinner Inc.	EX-R1001	Dispositif de commande pour Exodisc
FBS appauvri en exosomes	Thermo Fisher Scientific	A2720801	Nutriment d’un milieu de culture cellulaire pour la collecte d’VE dérivées de lignées cellulaires PC3
Sérum fœtal bovin (FBS)	VWR	1500 à 500	Nutriment pour la culture cellulaire
Chèvre Anti-Souris IgG H&L préadsorbé	ABCAM	AB7063	Anticorps IgG de souris pour le contrôle négatif du marquage EV
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm	Ibidi	Référence 81156	Boîte de culture pour l’imagerie confocale
Imaris 9.7.1	Oxford Instruments	9.7.1	Logiciel de post-traitement d’images
Système d’incubation+ mélangeur de gaz CO2/O2/N2	Instrument sur cellules vivantes	TU-O-20	Système d’incubation pour l’imagerie de cellules vivantes
Appareil photo Nikon A1 HD25 / A1R HD25	Nikon	Na	Caméra pour l’imagerie confocale
Microscope Nikon Eclipse Ti	Nikon	Na	Microscope inversé pour l’imagerie confocale
NIS-Elements AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Logiciel de traitement d’images pour microscope Nikon
NTA, NanoSight NS500	Malvern Panalytical	NS500	Appareil de mesure de la concentration de VE
OriginPro 2020	Laboratoire d’origine	Référence 9.7.0.185	Logiciel de représentation graphique
Pénicilline-streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotiques pour la culture cellulaire
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	21875034	Milieux de culture cellulaire pour la culture de lignées cellulaires PC3
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - Solution 5 mM dans DMSO	Thermo Fisher Scientific	Réf. S32703	Colorant fluorescent de coloration de l’ARN pour le marquage EV