Le test de capture de particules pseudo-virales : une méthode pour isoler les VLP affichant l’antigène d’un échantillon à l’aide de billes magnétiques conjuguées d’anticorps neutralisants

Résumé

Source : Rosengarten, J. F., et al. Détection d’épitopes sensibles à la neutralisation dans les antigènes affichés sur des vaccins à base de particules pseudo-virales (VLP) à l’aide d’un test de capture. J. Vis. Exp. (2022).

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test d’immunoprécipitation, appelé test de capture VLP, pour isoler des particules pseudo-virales présentant un antigène, ou VLP, à partir d’un échantillon. L’antigène se lie à des anticorps spécifiques liés à des billes magnétiques, formant un complexe antigène-anticorps immobilisé qui est ensuite séparé et stocké pour une analyse plus approfondie.

Protocole

1. Préparation des échantillons

1. Ensemencez les lignées cellulaires en suspension du producteur de VLP dérivées de cellules 293-F exprimant les gènes structurels du VIH gag seul ou de concert avec env à une faible densité cellulaire de 0,5 x 10⁶ cellules par mL dans le milieu d’expression 293-F.
2. Laissez-les se dilater pendant 3 à 4 jours à 37 °C et 8 % de CO₂ dans une rotation d’incubateur à agitateur avec une orbite de 5 cm et 135 tours par minute (tr/min).
3. Granulez les cellules productrices par centrifugation à 100 x g pendant 5 min. Filtrez le surnageant clarifié pour éliminer les cellules résiduelles et les débris cellulaires à l’aide de filtres à seringue à membrane en polyfluorure de vinylidène (PVDF) de 0,45 μm pour obtenir un surnageant de culture cellulaire libre (CFSN).
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Le CFSN peut être stocké toute la nuit à 4 °C.
4. Soit utiliser le CFSN directement pour l’expérience, soit granuler les VLP de 35 mL de CFSN en utilisant l’ultracentrifugation (112 700 x g, 4 °C, 1,5 h).
5. Lors de l’ultracentrifugation, jeter le surnageant et suspendre les pastilles VLP dans 200 μL de solution de tréhalose à 15 % (p/v) par tube à centrifuger.
   REMARQUE : La pastille VLP n’est souvent pas visible à l’œil nu. Le protocole peut être mis en pause ici. Les VLP peuvent être stockées à -80 °C.
6. Avant l’essai de capture de VLP, déterminer les concentrations de protéines de base virales dans les échantillons contenant des VLP à l’aide d’un test ELISA. Cette étape est importante pour normaliser les données d’entrée du test de capture.

2. Essai de capture VLP

REMARQUE : La figure 1 illustre une vue d’ensemble du flux de travail.

1. Suspendez les billes magnétiques en les pipetant de haut en bas ou en les mélangeant sur un rotateur à 50 tr/min pendant au moins 5 min.
2. Pendant ce temps, préparez la solution d’anticorps contenant les bNAbs. Utiliser 10 μg de chaque bNAb dans 200 μL de tampon de liaison et de lavage des anticorps (voir le tableau des matériaux) par réaction.
   REMARQUE : Les quantités d’anticorps peuvent varier en fonction de l’affinité du bNAb et de la densité de la décoration de l’antigène sur les VLP utilisées.
3. Utilisez 50 μL de la solution de billes magnétiques (voir le tableau des matériaux) par réaction et transférez les billes dans un tube réactionnel de 1,5 mL. Placez les tubes sur le support de séparation magnétique.
   REMARQUE : Alternativement, un aimant unique puissant peut être utilisé pour chaque tube afin de séparer les billes du surnageant.
4. Attendez quelques minutes jusqu’à ce que les billes se rassemblent sur la paroi du tube pour vous assurer que toutes les billes sont collectées. Retirez le surnageant.
5. Retirez l’aimant et suspendez les billes dans 200 μL de la solution bNAb préparée à l’étape 2.2. Incuber pendant 30 min à 3 h en mélangeant sur un rotateur à 50 tr/min à température ambiante.
6. Placez à nouveau les tubes de réaction dans le support de séparation magnétique, attendez et retirez le surnageant.
7. Retirez les tubes de l’aimant et lavez les billes en les remettant en suspension dans 200 μL de tampon de liaison et de lavage des anticorps.
8. Répétez l’étape 2.4. Retirez autant de tampon de lavage que possible.
9. Ajoutez les échantillons au fichier bNAbs.
   lié à des billes REMARQUE : L’entrée VLP pour le test de capture utilisant des particules dérivées du VIH doit être d’au moins 15 ng de protéine virale par réaction. Les quantités de VLP peuvent varier en fonction de l’affinité du bNAb et de la densité de décoration de l’antigène sur les VLP utilisés.
10. Si le volume d’échantillon ajouté à l’étape 2.9 est inférieur à 1 ml, ajoutez du PBS pour ajuster le volume d’échantillon à 1 ml. Suspendez doucement les billes par pipetage.
11. Incuber les échantillons et les billes pendant 2,5 h sur un rotateur à température ambiante. Assurez-vous que les billes restent en suspension et que la solution est bien mélangée pendant l’incubation.
12. Placez les tubes sur l’aimant et retirez le surnageant.
13. Lavez les billes magnétiques en les suspendant dans 200 μL de tampon de lavage (voir tableau des matériaux). Répétez l’étape de lavage trois fois.
14. Suspendez les billes dans 100 μL de tampon de lavage et transférez la suspension dans un tube de réaction propre (résistant à la chaleur).
15. Placez le tube sur le support de séparation magnétique (voir tableau des matériaux) et retirez complètement le surnageant.
16. Préparez des échantillons FDS-PAGE dénaturés en suivant les étapes 2.16.1 à 2.16.2 ou des échantillons non dénaturés en éluant les VLP des billes magnétiques en suivant les étapes 2.16.3 à 2.16.5.
    1. Pour préparer des échantillons SDS-PAGE dénaturés, suspendre les billes dans 20 à 80 μL de tampon Laemmli (0,8 μL de tampon Laemmli pour 1 ng d’entrée de test p55 Gag) et incuber à 95 °C pendant 5 min.
    2. Procédez directement avec SDS-PAGE ou stockez les échantillons à -20 °C.
       ATTENTION : Le tampon Laemmli contient du 2-mercaptoéthanol et du dodécylsulfate de sodium. Portez des gants de protection et des lunettes de protection. Évitez tout contact avec la peau, les yeux et les vêtements. N’inhalez pas de vapeurs. Travailler dans un espace bien ventilé, par exemple une hotte.
       REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
    3. Alternativement, effectuez une étape d’élution non dénaturante pour obtenir des VLP avec une structure protéique native préservée.
    4. Ajouter 25 μL de tampon d’élution (souvent fourni avec les billes) aux billes magnétiques et incuber pendant 2 à 5 minutes à température ambiante.
    5. Retirez les billes et transférez l’éluat dans un tube propre. Utilisez l’éluat pour des dosages ultérieurs ou stockez-le à 4 °C.
       REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

Résultats

Figure 1 : Illustration schématique des étapes clés du test de capture VLP à l’aide de surnageants acellulaires. (1) Le test de capture VLP commence par la liaison des bNAbs du VIH-1 aux billes magnétiques couplées à la protéine G. Pendant ce temps, la solution VLP avec une concentration définie de p55 est préparée. Le surnageant de culture acellulaire est constitué d’un mélan...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de réaction de 1,5 mL	Eppendorf
10 fois par PBS	gibco	70011044
Anticorps (bnAbs)	Polymun Scientic
Dynabeads Protéine G Kit d’immunoprécipitation	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	10007D	Comprend les tampons et le lavage Solutions
Cellules FreeStyle 293-F	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	Référence R790-07
FreeStyle 293 Médium d’expression	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	12338026
Rack de séparation magnétique	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	S1509S	pour 12 tubes de 1,5 mL ou 6 tubes de 1,5 mL
Ultracentrifugeuse Optima XE-90	Beckman Coulter
Fluorure de polyvinylidène (PVDF) filtres à seringue, 0,45 μm	Carl Roth	KC89.1
Membrane de transfert PVDF, 0,45 μm	Carl Roth	Réf. T830.1
QuickTiter HIV p24 ELISA	Biolabs cellulaires	VPK-108-H
rotateur	Heidolph	REAX2
Rotor SW28	Beckman Coulter
Thermomélangeur	Médias en celluloïd	basique
Tréhalose dihydraté	Carl Roth	Référence 8897.2
Tubes à centrifuger ultra clairs	Beckman Coulter	344058