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1. Nouvelle conception de la chambre (Figure 1)
- Ouvrez une nouvelle plaque d’analyseur de cellules à double chambre. Mettez de côté la chambre supérieure avec des électrodes.
- À l’aide d’une fraiseuse, rasez 2 mm des puits inférieurs en forme de U de la plaque de l’analyseur de cellules.
- Fixez une membrane en polyéthersulfone (PES) de 2 cm x 7 cm avec des pores de 0,2 μm au fond des puits rasés à l’aide d’un adhésif anti-UV. Prévoyez un temps de séchage de 30 minutes pour vous assurer que la colle est complètement durcie et inerte.
- À l’aide d’une fraiseuse, découpez deux fentes longitudinales (1,5 mm x 5,6 mm) le long des côtés pour les enclencher dans les crêtes de la troisième chambre nouvellement fabriquée.
- À l’aide d’une fraiseuse, créez une troisième chambre en polycarbonate qui reproduit les dimensions globales de la plaque de l’analyseur de cellules : 72 mm x 18 mm (tableau des matériaux).
- Créez des puits de 4,8 mm de profondeur et de 4,75 mm de diamètre pour reproduire la conception à 16 puits de la plaque de l’analyseur de cellules. Cela permet d’obtenir un volume de 90 μL par puits.
- Sur les côtés, créez deux crêtes triangulaires afin que la chambre se verrouille dans les fentes d’origine créées à l’étape 1.4. La partie horizontale du triangle est de 1,5 mm, la verticale de 1,4 mm et l’hypoténuse de 2,052 mm.
- Créez un bouton sur le côté court de 50,8 mm de diamètre et de 1,397 mm de hauteur pour l'adapter à l'encoche de la plaque d'origine (Figure 1, milieu).
- Utilisez une rondelle en caoutchouc de 0,9 mm d’épaisseur pour chaque puits afin d’assurer un ajustement étanche.
2. Culture cellulaire (fibroblastes MDA-MB-231, CCIS, CCIS-Δ4, J2)
- Laver les cultures cellulaires adhérentes (~70 % de confluence) avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Ajouter une solution de trypsine-EDTA à 0,05 % pour soulever les cellules.
- Neutralisez la solution de trypsine avec un milieu de culture cellulaire contenant du sérum et comptez les cellules à l’aide d’une aliquote de la suspension cellulaire.
note: Les milieux de culture cellulaire spécifiques se trouvent dans le tableau 1.
3. Dissociation de la xénogreffe dérivée du patient
- Coupez un morceau de tumeur fraîche (1 cm2) en fine bouillie à l’aide d’un scalpel stérile.
- Placer dans un tube conique de 50 mL avec 20 mL de milieu DMEM F12 complété par 3 mg/mL de trypsine et 2 mg/mL de collagénase.
- Incuber dans un agitateur thermique (150 tr/min) à 37°C pendant 20 min.
- Faites tourner le tube à 500 x g pendant 5 min, retirez le surnageant.
- Ajouter 20 μL de DMEM F12 + 2 % FBS pour laver les cellules ; essorer à 300 x g pendant 5 min et retirer le surnageant. Répétez le lavage deux fois de plus.
- Mettre à nouveau en suspension dans 1 mL de milieu PDX (tableau 1) pour compter les cellules.
4. Extraction de cellules de moelle osseuse
- Rincer le filtre de prélèvement de la moelle osseuse (BM) avec 25 mL de 1x PBS.
note: Dans cette étude, le PBS a été ajouté à un filtre de collecte de BM usagé de l’hôpital pour collecter les BM restants dans le filtre.
- Ajoutez lentement le BM rincé dans un tube conique de 50 ml avec 25 ml de milieu de gradient de densité, en prenant soin de garder les couches aussi séparées que possible.
- Essorage à 800 x g pendant 20 min à 18 °C.
- Siphonnez les couches supérieures après centrifugation (graisse/plasma) et transférez 5 mL de la couche blanche au-dessus du milieu à gradient de densité qui contient les cellules BM dans un tube conique de 15 mL.
note: Vous pouvez également tremper une pipette de 5 ml dans la couche supérieure jusqu’à ce qu’elle touche la couche intermédiaire (BM), et pipeter la couche intermédiaire très lentement sans déplacer la pipette.
- Remplissez le tube conique de 15 mL avec 1x PBS (~10 mL) et tournez à 300 x g pendant 15 min.
- Retirez le surnageant, la pastille blanche restante est le BM.
- Si des globules rouges sont observés dans la cuiller, ajoutez 5 mL de solution de lyse des globules rouges (Table des matières) et laissez-la reposer pendant 5 min à température ambiante (RT). Essorer à 300 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
- Ajouter 10 ml de 1x PBS pour laver les cellules, essorer à 300 x g pendant 5 min et retirer le surnageant. Répétez la lyse des globules rouges (étape 4.7) jusqu’à ce que la pastille soit blanche.
5. Ensemencement et assemblage des cellules
- Placez les trois chambres stériles dans le capuchon de culture tissulaire.
- Localisez le bouton sur le côté court de la chambre inférieure. Orientez la chambre inférieure de manière à ce que le bouton soit face à l’expérimentateur.
- Ajoutez 30 000 à 50 000 cellules dans 90 μL de milieu dans chaque puits de la chambre inférieure. Évitez de former des bulles. Ce sont les cellules stromales qui fourniront des facteurs sécrétés mais qui ne seront pas détectées par les électrodes de la chambre supérieure.
- Utilisez un milieu supplémenté en sérum de veau fœtal à 5 % dans deux puits de la chambre inférieure comme contrôle positif de la motilité cellulaire. Utilisez un milieu supplémenté à 0 % de sérum comme contrôle négatif.
- Laissez la chambre inférieure avec les cellules reposer pendant 10-15 min dans la hotte pour qu’elle se dépose.
note: Cette étape est recommandée si les cellules sont adhérentes ou se développent en suspension.
- Faites pivoter la chambre inférieure à 90° et placez la chambre centrale sur le dessus de sorte que le bouton de la chambre inférieure glisse dans l’encoche de la chambre centrale.
note: Le bouton sur la chambre inférieure et le point bleu sur la chambre centrale se trouvent aux extrémités opposées de l’ensemble.
- Poussez verticalement vers le bas jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre de chacun des côtés longs de l’ensemble.
- Ajoutez 160 μL de milieu sans sérum dans tous les puits de la chambre centrale.
- Assurez-vous qu’un ménisque en forme de dôme est visible après le remplissage des puits ; sinon, ajustez le volume final en fonction de l’étalonnage de la pipette. Évitez de former des bulles.
- Placez la chambre supérieure avec les électrodes vers le bas sur la chambre centrale en veillant à aligner les points bleus sur les chambres centrale et supérieure.
- Poussez verticalement vers le bas jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre de chacun des côtés longs de l’ensemble.
- Ajoutez 25 à 50 μL de milieu sans sérum dans la chambre supérieure.
- Montez l’ensemble sur l’analyseur de cellules à double usage dans l’incubateur de culture tissulaire et attendez 30 min avant de mesurer le bruit de fond.
note: Ce temps est nécessaire pour équilibrer le réseau et peut être utilisé pour préparer les lignées cellulaires à ajouter à la chambre supérieure.
- Mesurez l’arrière-plan (voir section 6) et remettez l’ensemble dans le capot de culture tissulaire.
- Ajoutez 30 000 à 50 000 cellules dans 100 μL de milieu sans sérum dans chaque puits de la chambre supérieure. Ce sont les cellules que l’électrode détectera une fois qu’elles auront réussi à migrer à travers la membrane
note: Pour obtenir une réponse maximale, il est recommandé de cultiver des cellules dans un milieu sans sérum ou à faible teneur en sérum pendant 6 à 18 heures avant d’effectuer le test.
- Laissez l’ensemble reposer dans le capot pendant 30 minutes avant de le monter sur l’analyseur de cellules à double usage pour la mesure d’impédance.
6. Mesure de l’arrière-plan et de l’impédance
- Placez le réseau dans le socle de l’analyseur de cellules à double usage.
- Ouvrez le logiciel de l’analyseur de cellules et sélectionnez la station d’accueil à utiliser.
- Cliquez sur l’onglet Message et assurez-vous qu’il indique Connexions OK pour vous assurer que le réseau est bien placé dans le socle et que les électrodes sont bien alignées avec les capteurs.
- Cliquez sur l’onglet Notes d’expérience et remplissez autant d’informations que possible sur l’expérience.
- Cliquez sur l’onglet Mise en page et remplissez la description de la disposition du tableau.
- Cliquez sur l’onglet Calendrier et ajoutez deux étapes à partir du menu Étapes : une étape d’arrière-plan (un balayage) et une étape de test avec 100 balayages, soit un balayage toutes les 15 minutes, pour un total de 25 h.
- Une fois que le réseau a été dans l’incubateur de l’analyseur de cellules à double usage pendant 30 minutes, cliquez sur le bouton Lecture pour lancer la mesure en arrière-plan. Une fenêtre vous demandant de choisir le dossier pour enregistrer les données apparaîtra.
- Une fois la mesure de l’arrière-plan terminée, retirez le réseau du socle et remettez-le dans le capot de culture cellulaire.
- Ajoutez les cellules dans la chambre supérieure comme décrit à l’étape 5.13 et maintenez l’ensemble dans le capot de culture tissulaire pendant 30 minutes pour que les cellules se déposent.
- Replacez la matrice dans l’analyseur de cellules à double usage et recherchez le message Connexions OK dans l’onglet Message.
- Cliquez sur le bouton Lecture pour lancer la mesure d’impédance.
- Cliquez sur l’onglet Tracé pour surveiller la progression du signal.
- Si le point final est atteint avant 25 h, cliquez sur l’étape Abandonner dans le menu déroulant Exécuter.
- Pour exporter des données, cliquez avec le bouton droit de la souris sur le graphique, choisissez Copier au format de liste, puis collez les données dans une feuille de calcul.
note: Les données peuvent être exportées sous forme d’index de cellule ou d’index de cellule delta. Les informations de graphique et/ou de mise en page peuvent également être sélectionnées pour l’exportation.
Tableau 1 : Composition des milieux de culture cellulaire. Le tableau répertorie les compositions des milieux MDA-MD-231, des milieux J2 Fibroblasts, des milieux CCIS et des milieux PDX.
| média | Constituants | Concentration/proportion |
| Supports MDA-MD-231 | DMEM | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | 10 % |
| Média J2 Fibroblastes | DMEM | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | 10 % |
| Médias CCIS | DMEM F12 | |
| Sérum de cheval (HS) | 5 % |
| Facteur de croissance épidermique (EGF) | 20 ng/mL |
| insuline | 10 μg/mL |
| Hydrocortisone | 0,5 μg/mL |
| Toxine cholérique | 100 ng/mL |
| Médias PDX | DMEM F12 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | 2 % |
| HEPES | 1 M |
| Insuline Transferrine Sélénium Éthanolamine (ITS) | 10 μg/mL |
| Hydrocortisone | 0,5 μg/mL |
| Albumine sérique bovine (BSA) | 1 mg/mL |
