Dosage de l’activité de la citrate synthase : un dosage colorimétrique pour mesurer l’activité de la citrate synthase mitochondriale dans l’homogénat du tissu de la drosophile

Résumé

Source : Wei, P., et al., A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo décrit un test colorimétrique pour mesurer l’activité de la citrate synthase mitochondriale présente dans l’homogénat tissulaire de la drosophile.

Protocole

1. Dosage colorimétrique de l’activité de la citrate synthase pour D. melanogaster

1. Prélever dix mouches adultes pour chaque échantillon. Prélever au moins trois échantillons pour chaque génotype.
2. Préparez 500 μL de tampon d’extraction glacé contenant 20 mM d’HEPES (pH = 7,2), 1 mM d’EDTA et 0,1 % de triton X-100 dans un tube à essai de 1,5 mL pour chaque échantillon.
3. Anesthésie les mouches adultes avec du CO₂ sur un tampon d’anesthésie et isole les tissus souhaités. Pour isoler les thorax des mouches adultes, par exemple, fixez les thorax des mouches à l’aide d’une paire de pinces, puis isolez les abdomens des mouches en coupant le long du bord du thorax et de l’abdomen à l’aide d’une paire de ciseaux. Prélever les thorax des mouches pour le test d’activité de la citrate synthase musculaire.
   note: Déterminez le poids frais du tissu à cette étape si vous l’utilisez pour normaliser l’activité de la citrate synthase.
4. Transférez immédiatement 10 thorax de mouches adultes dans 100 μL de tampon d’extraction glacé et homogénéisez avec un pilon sur glace. Pour garder les échantillons glacés, homogénéisez les échantillons pendant 5 à 10 secondes sur de la glace, puis faites reposer les échantillons sur de la glace pendant 5 secondes et répétez jusqu’à ce que tous les tissus du tube soient complètement homogénéisés.
   note: Collez le tube, vérifiez les homogénats pour vous assurer qu’il n’y a pas de caillots dans les homogénats et que les tissus du tube sont complètement homogénéisés. Tous les traitements d’échantillons doivent être effectués sur de la glace.
5. Prélever 10 μL de chaque échantillon homogénéisé dans un nouveau tube pour la mesure de la teneur en protéines. Conservez les échantillons pour la mesure des protéines sur ice.
   note: Les échantillons de protéines peuvent être congelés et stockés à -80 °C pour une analyse ultérieure. Les concentrations en protéines servent de paramètre interne pour la normalisation des activités de la citrate synthase.
6. Ajoutez 400 μL de tampon d’extraction glacé à chaque échantillon restant pour obtenir un volume total de 500 μL. Mélangez bien en pipetant doucement de haut en bas au moins 5 fois, en évitant la formation de bulles. Pour chaque réaction, ajouter 1 μL de lysat cellulaire dilué à 150 μL de solution réactionnelle fraîchement préparée (20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM de DTNB, 0,3 mM d’acétyl CoA, 1 mM d’acide oxaloacétique). Mélangez soigneusement et immédiatement en pipetant doucement, en évitant la formation de bulles. Mesurer l’absorbance à 412 nm toutes les 10 à 30 s pendant 4 min à 25 °C à l’aide d’un lecteur de plaques capable de mesurer l’absorbance à 412 nm à des intervalles minimaux de 10 s.
   note: Changez l’embout avant de pipeter un autre réactif et évitez de former des bulles dans les puits. Un mélange incomplet des réactifs peut entraîner des variations dans les mesures. Le dosage de l’activité de la citrate synthase doit être effectué à température ambiante immédiatement après le prélèvement des échantillons, car ce test est utilisé pour quantifier la masse mitochondriale intacte. Le tampon de réaction doit être préparé immédiatement avant l’utilisation et ne doit pas être stocké.
7. Tracez les données sous forme de densité optique (OD), d’absorbance (abs) (axe Y) en fonction du temps (en minutes) (axe X). Calculez ensuite la pente de la partie linéaire de la courbe, où la vitesse de réaction est
   

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide 2-[4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinyl]éthanesulfonique (HEPES)	Sigma-Aldrich	V900477
2-Amino-2-(hydroxyméthyl)-1,3-propanediol (base TRIZMA)	Sigma-Aldrich	V900483
Acétyl-CoA	Sigma-Aldrich	A2181
Acide dithio-bis-nitrobenzoïque (DTNB)	Sigma-Aldrich	D8130
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma-Aldrich	V900106
oxaloacétate	Sigma-Aldrich	O4126
Pilon à granulés	Sangon	F619072
Moteur pilon à granulés	Tiangen	OSE-Y10
Lecteur de plaques	BioTek	éon
Kit de dosage des protéines BCA	Beyotime	P0010S
ciseaux	WPI	Référence 14124
Triton X-100	Sangon	A110694-0100