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1. Inoculation cellulaire
- Commencez par une culture de cellules épithéliales humaines A549 dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) à haute teneur en glucose avec du rouge de phénol, complétée par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) sans antibiotiques.
- Observez chaque puits de la plaque à 24 puits par microscopie à faible grossissement pour vous assurer que les cellules épithéliales humaines sont saines et se développent comme prévu.
- Retirez et jetez le milieu de culture cellulaire épuisé de la plaque à 24 puits.
- Ajouter 500 μL de la suspension bactérienne de Staphylococcus aureus préparée dans du DMEM sans rouge de phénol, pour l’inoculation à chaque puits avec 100 % de cellules confluentes.
- Incuber les cellules pendant 2 h à 36 ± 1 °C et 5 % CO2.
REMARQUE : il est recommandé d’utiliser trois puits de la plaque pour chaque condition à tester (en trois exemplaires) et d’effectuer au moins trois expériences indépendantes. Le délai d’incubation peut être adapté en fonction de l’objectif expérimental.
2. Quantification des bactéries intracellulaires avec un test de protection enzymatique amélioré (iEPA)
- Préparez 7 mL de tampon de lyse 4x avec 3,5 mL de Triton X-100 à 2 % dans de l’eau stérile et 3,5 mL de trypsine-EDTA.
- Préparer une solution mère de lysostaphine à 10 mg/mL dans un tampon d’acétate et une aliquote de 25 μL dans des flacons cryogéniques. Conserver à -80 °C jusqu’à 6 mois.
- Préparez 250 μL d’une solution de travail de lysostaphine fraîche à 1 mg/mL en mélangeant 25 μL de la solution mère de lysostaphine (10 mg/mL) et 225 μL de Tris-HCl 0,1 M. Conserver à 4 °C jusqu’à 48 h.
- Préparez 6,25 mL de milieu d’infection complet complété par de la lysotapphine en ajoutant 6 mL de milieu d’infection complet à 250 μL de solution de travail de lysostaphine.
- Ajoutez 250 μL de milieu infectieux complet complété par de la lysostaphine dans chaque puits et agitez doucement la plaque en la faisant pivoter à la main.
- Incuber les cellules pendant 1 h à 36 ± 1 °C dans 5 % de CO2 pour laisser la lysostaphine tuer les bactéries extracellulaires.
- À la fin de la période d’incubation, ajouter 10 μL de protéinase K à 20 mg/mL dans chaque puits pour inactiver la lysostaphine.
- Incuber les cellules pendant 2 min à température ambiante.
- Ajouter 250 μL de tampon de lyse 4x pour lyser les cellules par choc osmotique.
- Incuber les cellules pendant 10 min à 36 ± 1 °C.
- Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas dix fois sur tout le fond du puits pour vous assurer que les cellules sont complètement lysées et homogénéisées.
- Utilisez un plateau à spirale automatique pour déterminer la charge de S. aureus de chaque puits.
- Incuber les plaques de gélose pendant 18 à 24 h à 36 ± 1 °C.
- Le lendemain, comptez le nombre de colonies à l’aide d’un compteur de colonies pour calculer la charge intracellulaire de S. aureus de chaque puits.