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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE
1. Préparation de la solution
REMARQUE : Manipulez et préparez tous les réactifs et solutions avec de la verrerie sans fer ou de la vaisselle en plastique jetable. Ne laissez pas les matériaux métalliques de laboratoire (par exemple, les spatules en acier inoxydable) entrer en contact avec un réactif ou une solution, en raison du risque de contamination par le fer. Assurez-vous que toute verrerie réutilisable est sans repassage. Lavez les matériaux avec un détergent de laboratoire approprié pendant 30 à 60 min, rincez à l’eau déminéralisée, trempez toute la nuit dans une solution d’acide nitrique à 37 % diluée 1:3 avec de l’eau déminéralisée, rincez à nouveau avec de l’eau déminéralisée et laissez sécher.
- Mélange d’acides : Ajouter 10 g d’acide trichloracétique à 82,2 mL d’acide chlorhydrique à 37 % dans une bouteille en verre, dissoudre complètement et ajuster le volume final à 100 mL avec de l’eau déminéralisée. Agiter avant utilisation. Vous pouvez également utiliser uniquement de l’acide chlorhydrique à 37 % pour la digestion des tissus.
note: La solution est stable pendant au moins 2 mois lorsqu’elle est stockée dans des flacons de réactifs en verre brun foncé.
prudence: L’acide chlorhydrique et l’acide trichloracétique sont corrosifs et les formes concentrées libèrent des vapeurs acides toxiques. Portez des vêtements de protection, des gants résistants aux produits chimiques et des lunettes anti-éclaboussures de produits chimiques en tout temps lorsque vous manipulez des acides. Évitez de les respirer et manipulez toujours les acides sous une hotte.
- Acétate de sodium saturé : Ajouter 228 g d’acétate de sodium anhydre à 400 ml d’eau déminéralisée dans une bouteille en verre et agiter toute la nuit à température ambiante. Laissez reposer la solution et précipiter pendant une journée. S’il n’y a pas de précipitations, continuez à ajouter de petites quantités d’acétate de sodium. Conservez la solution dans un flacon en verre.
- Réactif chromogène : Pour préparer 1 mL de réactif chromogène, ajoutez 1 mg de sel disulfonique disulfonique de l’acide 4,7-diphényl-1,10-phénanthroline disodique à 500 μL d’eau désionisée et à 10 μL d’acide thioglycolique concentré (100 %), puis dissolvez-le complètement. Compléter le volume final à 1 mL avec de l’eau déminéralisée.
note: Préparez autant de réactif chromogène que nécessaire. La solution est stable pendant 1 mois à l’abri de la lumière.
- Réactif Chromogen de travail (WCR) : Ajouter 1 volume de réactif Chromogen à 5 volumes d’acétate de sodium saturé et 5 volumes d’eau désionisée.
note: Cette solution doit être préparée fraîchement le jour de l’utilisation.
- Solution étalon de fer mère : Pour préparer une solution mère de fer de 20 mM, placez 111,5 mg de poudre de fer carbonyle dans une fiole jaugée de 250 mL contenant 5 480 μL d’acide chlorhydrique à 37 %. Laisser dissoudre une nuit à température ambiante (ou incuber au bain-marie bouillant). Ensuite, préparez la solution jusqu’à un volume final de 100 mL avec de l’eau désionisée.
note: La solution standard peut être conservée indéfiniment lorsqu’elle est stockée dans un récipient hermétiquement fermé.
- Solution étalon de fer (WISS) : Ajouter 13,5 μL d’acide chlorhydrique à 37 % à 500 μL d’eau déminéralisée. Ajouter 10 μL de la solution étalon de fer mère et porter le volume final à 1 mL avec de l’eau désionisée (11,169 μg de Fe/mL, 200 μM ; mesuré par AAS).
note: La solution de travail doit être préparée fraîchement le jour de l’utilisation.
2. Séchage des échantillons
- Coupez un échantillon de tissu pesant de 10 à 100 mg à l’aide d’une lame de scalpel. Pesez-le avec précision dans une balance analytique/de précision sur un petit morceau de parafilm (Fresh Weight).
- À l’aide d’une pince à épiler en plastique, placez le morceau de tissu dans une plaque à 24 puits (sans couvercle pour permettre l’évaporation de l’eau) et laissez-le sécher sur un incubateur standard à 65 °C pendant 48 h.
- Vous pouvez également utiliser un four de digestion par micro-ondes de laboratoire pour sécher les échantillons de tissus. À l’aide d’une pince à épiler en plastique, placez le morceau de tissu pesé dans un gobelet en téflon sans fer et séchez-le au micro-ondes. Réglez les paramètres de fonctionnement conformément au manuel d'instructions de l'instrument.
note: À titre de référence, les paramètres de fonctionnement pour le séchage des échantillons de foie à l’aide du four de digestion spécifique (voir tableau des matériaux) sont indiqués dans le tableau 1.
- À l’aide d’une pince à épiler en plastique, placez chaque morceau de tissu séché sur un petit morceau de parafilm à l’intérieur d’une balance analytique/de précision et pesez-le avec précision (poids sec).
3. Digestion acide de l’échantillon
- À l’aide d’une pince à épiler en plastique, transférez chaque morceau de tissu séché dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
- Ajouter 1 mL du mélange acide et fermer le tube de la microcentrifugeuse. Préparez un blanc acide de la même manière, sauf que le tissu est omis.
prudence: Le mélange acide est corrosif et dégage des vapeurs toxiques. Portez des vêtements de protection, des gants résistant aux produits chimiques et des lunettes anti-éclaboussures de produits chimiques lorsque vous manipulez le mélange acide. Évitez de le respirer et manipulez-le toujours sous une hotte.
- Digérer les tissus en incubant les tubes de microcentrifugation dans un incubateur à 65 °C pendant 20 h.
- Après refroidissement à température ambiante, transférez 500 μL de l’extrait acide clair (jaune) (surnageant) dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’une micropipette munie d’embouts en plastique. S’il n’est pas possible d’obtenir un surnageant clair, effectuer une courte centrifugation spin.
prudence: Le surnageant est très acide. Portez des vêtements de protection, des gants résistant aux produits chimiques et des lunettes anti-éclaboussures de produits chimiques lorsque vous manipulez les surnageants. Manipulez-les toujours sous une hotte.
note: À ce stade, les extraits acides peuvent être immédiatement utilisés pour le dosage colorimétrique ou congelés à -20 °C pour une utilisation ultérieure. Décongelez complètement les échantillons congelés à température ambiante et agitez-les avant de les utiliser.
4. Développement des couleurs
- Préparez les réactions chromogènes comme indiqué dans le tableau 2 dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL ou, pour un débit plus élevé, directement dans les microplaques de polystyrène transparent à fond plat de 96 puits, non traitées. Préparez toutes les réactions (blanc d’acide, étalon et échantillon) au moins en deux exemplaires.
- Incuber à température ambiante pendant 15 min.
5. Lecture de l’absorbance
- Mesurer l’absorbance de l’échantillon dans un spectrophotomètre ou un lecteur de plaques à une longueur d’onde de 535 nm par rapport à une référence d’eau désionisée. Les plaques peuvent être lues sans couvercle ou avec couvercle. Dans le cas du couvercle, éliminez toute condensation formée en raison de la libération de vapeurs acides du couvercle juste avant la mesure afin d’éviter toute interférence possible avec la lecture de l’absorbance.
note: L’absorbance optique de l’ébauche d’acide lue contre l’eau désionisée (référence) doit être inférieure à 0,015 ; L’absorbance optique de l’étalon et des échantillons doit être comprise entre 0,100 et 1,000. Pour les échantillons à teneur en fer très élevée ou très faible, il peut être nécessaire d’ajuster les volumes d’extrait acide (surnageant) et de diH2O (tableau 2) : si l’absorbance est supérieure à 1,0, utiliser un volume d’échantillon plus petit (surnageant) ; Lorsque l’absorbance est inférieure à 0,1, utilisez un volume plus élevé de surnageant. Le volume de l'échantillon (Vsmp) est pris en compte dans le calcul de la teneur en fer de chaque échantillon (voir étape 6).
6. Calcul de la teneur en fer des tissus
- Calculez la teneur en fer des tissus non héminiques à l’aide de l’équation suivante :
Tableau 1 : Paramètres de fonctionnement pour le séchage du foie dans un four à digestion par micro-ondes utilisé ici
| Puissance 650W ( %) : | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Pression (PSI) : | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Temps (min) : | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Temps à la pression (TAP) : | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| éventail: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tableau 2 : Préparation des réactions chromogènes dans des tubes de 1,5 mL ou des plaques à 96 puits.
| | BFR (μL) | Mélange acide (μL) | Surnageant (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Volume total (μL) |
| tubes de 1,5 mL | Blanc acide | 1000 | 150 | | | 150 | 1300 |
| standard | 1000 | 150 | | 150 | | 1300 |
| échantillon | 1000 | | variable | | variable | 1300 |
| microplaque à 96 puits | Blanc acide | 150 | 22,5 | | | 22,5 | 195 |
| standard | 150 | 22,5 | | 22,5 | | 195 |
| échantillon | 150 | | variable | | variable | 195 |