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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Expansion des progéniteurs OC
- Mettre en suspension les PBMC dans du α-MEM complet (10 % FBS, 1 % Pen/Strep, 1 % amphotéricine B) contenant 20 ng/mL DE M-CSF. Grainez des PBMC à une densité de 2,5 x 105 cellules/cm2. Habituellement, les cellules isolées à partir de 15 à 20 ml de sang frais peuvent être ensemencées dans une fiole de75 cm (1,5 à 2 x 107 cellules).
- Nourrir les cellules avec du α-MEM complet frais contenant 20 ng/mL DE M-CSF tous les trois jours jusqu’à ce que les cellules attachées atteignent la confluence souhaitée. Les rendements typiques sont de 1,5-2 x106 cellules/flacon lorsque les cellules sont confluentes à 95 %. Habituellement, la période d’extension dure 6 jours.
note: Le potentiel ostéoclastogène des précurseurs peut diminuer avec un temps de culture prolongé.
2. Induction de l’ostéoclastogenèse dans des plaques recouvertes de phosphate de calcium
- Pour faciliter l’adhésion cellulaire, incuber les plaques revêtues de phosphate de calcium (CaP) avec 50 μL de FBS pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C.
- Pour détacher les précurseurs de CO, laver deux fois le ballon avec du PBS pour éliminer les cellules mortes ou non adhérentes. Ajouter 4 mL de trypsine (table des matières) par flacon de 75 cm2, pendant 30 min.
- Ajoutez 4 ml de α-MEM complet pour arrêter la digestion, détachez soigneusement les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférez les cellules dans un tube de 50 ml.
- Déterminez le nombre total de cellules à l’aide d’une chambre Neubauer ou similaire.
- Granuler les cellules par centrifugation pendant 7 min à 350 x g. Remettre en suspension la pastille dans un α-MEM complet suffisant contenant 20 ng/mL DE M-CSF et 20 ng/mL de RANKL pour obtenir une concentration de 1 x 106 cellules/mL.
- Aspirer la solution FBS de la plaque de 96 puits revêtue de CaP et pipeter 200 μL de suspension cellulaire par puits (2 x 105 cellules/puits).
- Incuber les précurseurs de CO pendant la période souhaitée ou avec les réactifs souhaités pertinents pour la conception expérimentale. Habituellement, un grand nombre de CO volumineux et multinucléés peuvent être observés après 6 jours et lorsque des fosses de résorption se forment. Nourrir les cellules avec un milieu α-MEM complet frais contenant 20 ng/mL DE M-CSF et 20 ng/mL de RANKL tous les trois jours.
- À la fin de l’incubation, laver les cellules avec du PBS deux fois, fixer avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes et laver à nouveau avec du PBS.
- Utilisez les CO fixes directement pour la coloration par fluorescence ou stockez-les à 4 °C.
3. Coloration par fluorescence des CO et revêtement de phosphate de calcium
- Incuber les cellules fixées avec un tampon de perméabilisation (0,1 % de Triton dans PBS) pendant 5 min.
- Colorez les filaments d’actine avec 100 μL de solution de phalloïdine marquée à AlexaFluor 546 dans du PBS pendant 30 min et aspirez la solution de coloration. Ajouter 100 μL de solution de coloration Hoechst 33342 (10 μg/mL dans du PBS) pendant 10 minutes pour colorer les noyaux. Le DAPI peut également être utilisé.
- Teinture CaP avec 100 μL de calcéine 10 μM dans du PBS pendant 10 min. Laver trois fois avec du PBS et prendre des images.