Dosage de l’oxydation du substrat dans les cellules en culture : un dosage in vitro pour quantifier l’oxydation du substrat dans les cellules en mesurant les signaux radioactifs du CO2 piégé

Résumé

Source : Song, C. et al., Évaluation de l’oxydation du substrat énergétique in vitro avec piégeage de ¹⁴CO₂. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo présente une technique de quantification du_CO2 libéré lors de l’oxydation du substrat à l’aide de ¹⁴substrats radiomarqués au carbone. Les ¹⁴CO₂ libérés sont piégés dans une solution alcaline et quantifiés par un compteur à scintillation. L’oxydation des différents substrats varie entre les tissus et reflète l’état physiopathologique du tissu.

Protocole

L’utilisation de matières radioactives (MAR) nécessite l’approbation préalable d’un comité de sécurité désigné dans chaque établissement.

1. Préparation de solutions mères pour ¹⁴substrats marqués au carbone

1. Préparez une solution mère d'albumine sérique bovine (BSA) de 4 mM en mélangeant 11 g de BSA et 33,1 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) et en l'agitant doucement à température ambiante pendant ~3 h jusqu'à ce que BSA soit complètement dissous. Réchauffez la solution mère BSA dans un bain-marie à 70 °C avant utilisation.
2. Faites sécher à l’air libre 50 μCi ¹⁴C-oléate (50 μCi/μmol dans de l’éthanol) dans le flacon avec le couvercle retiré pendant 8 h dans une hotte de travail RAM désignée. Ajouter 312,5 μL de H₂O, puis 3,5 mg (11,5 μmol) d’oléate de sodium. Mélanger.
3. Réchauffez la solution obtenue à 70 °C dans un bain-marie. Ajouter 0,9375 mL de la solution mère de BSA préchauffée pour obtenir une solution mère d’oléate chaude de 10 mM (contenant un rapport de 1:11,5 entre le ¹⁴C-oléate et l’oléate non marqué). Aliquote la solution mère et conserve-la à -20 °C pour une utilisation à long terme.
4. Utilisez ^{le 14}C-glucose et le ¹⁴C-glutamine directement après la décongélation.

2. Préparation d’un milieu contenant ¹⁴substrats marqués au carbone

REMARQUE : Pour garantir des concentrations fiables de substrats énergétiques dans le milieu, il faut utiliser des substrats sur mesure avec des substrats frais ajoutés peu de temps avant l’utilisation. Ici, un milieu essentiel minimum (MEMα) sur mesure sans glucose, pyruvate, glutamine, rouge de phénol ou bicarbonate de sodium est utilisé. Cependant, un milieu optimal doit être déterminé pour chaque type de cellule.

1. Reconstituez 8,67 g de la poudre moyenne dans 1 L d’eau purifiée. Ajouter 2,2 g de bicarbonate de sodium pour obtenir un pH de 7,4 et filtrer la solution à l’aide d’une filtration sous vide de 0,22 μm.
2. Ajouter des ingrédients frais pour obtenir le milieu complet (cMEMα) avec des concentrations finales de 5,5 mM de glucose, 2 mM de glutamine, 1 mM de pyruvate et 10 % de sérum fœtal bovin (FBS). Complétez davantage cMEMα avec 100 mM de L-carnitine et 10 μM d’HEPES pour faciliter l’oxydation des acides gras.
3. Immédiatement avant l’utilisation, ajoutez ¹⁴substrats marqués C à du cMEMα fraîchement préparé pour obtenir un support chaud. Pour obtenir un milieu chaud d’oléates, ajouter la solution mère d’oléate chaud de 10 mM à du cMEMα pour obtenir une concentration finale d’oléate de 100 μM (dilution 1:100, radioactivité finale 0,4 μCi/mL).
   note: Le stock d’oléate chaud de 10 mM contenant un rapport de 1:11,5 entre l’oléate chaud et l’oléate froid (voir l’étape 1.3) est utilisé pour atteindre un niveau physiologique de 100 μM d’oléate total dans le milieu tout en minimisant la quantité de matières radioactives.
4. Préparez 10 mM d’oléate non marqué en ajoutant 24,36 mg d’oléate de sodium à 2 mL de H₂O dans un bain-marie à 70 °C pendant ~20 min jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous avant de mélanger rapidement avec 6 mL de la solution mère de BSA 4 mM préchauffée à 70 °C. Transférer dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 h et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Aliquote et conserver à -20 °C pour une utilisation à long terme.
5. Pour rendre le glucose chaud moyen, ajoutez ^{du 14}C-glucose à une concentration finale de 1,333 μM (dilution 1:4,125, radioactivité finale 0,4 μCi/mL). Pour rendre la glutamine moyennement chaude, ajoutez ^{de la 14}C-glutamine à la concentration finale de 2 μM (dilution 1:1 000, radioactivité finale 0,4 μCi/mL).
6. Compléter le milieu chaud de glucose et de glutamine avec une solution mère de 10 mM d’oléate non marqué de l’étape 2.4 pour obtenir la concentration finale de 100 μM d’oléate, la même que celle du milieu chaud d’oléate.

3. Préparation des cellules

REMARQUE : Les préostéoblastes calvaires et les macrophages de la moelle osseuse sont utilisés ici comme exemples. Les utilisateurs doivent préparer leur choix de type de cellule selon des protocoles appropriés. Optimiser la concentration de la collagénase II à utiliser pour la digestion dans des expériences pilotes, car l’activité enzymatique peut varier d’un lot à l’autre.

1. Isolement et culture de préostéoblastes calvaires
   1. Sacrifiez les petits postnatals du 3e au 5e jour (P3-5) par décapitation et transférez-les dans des DPBS glacés contenant de la pénicilline-streptomycine (P/S).
   2. Exposez le calvaria en enlevant la peau et les tissus mous. Prélevez la région médiane en coupant les tissus environnants de l’arrière vers l’avant dans le DPBS (figure 1A). Grattez doucement les surfaces intérieures et extérieures de la calvaria à l’aide d’une pince à épiler pour aider à libérer les cellules lors de la digestion ultérieure.
   3. Préparez une solution de 2 mg/mL et une solution de 4 mg/mL de collagénase de type II dans DPBS et filtrez chaque solution avec un filtre frais de 0,22 μm. Digérer d’abord le calvaria nettoyé avec la solution de collagénase à 2 mg/mL pendant 15 minutes et jeter la solution de digestion. Digérer les échantillons nettoyés dans une solution de collagénase à 4 mg/mL 3 fois pendant 15 minutes à chaque fois, en regroupant et en conservant la solution de digestion.
   4. Filtrer la solution de digestion à travers des filtres à cellules de 70 μm et centrifuger le filtrat à 300 × g pendant 5 min. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans du cMEMα (voir étape 2.2) contenant 10 % de FBS et de P/S.
   5. Comptez et ensemencez les cellules à 4 × 10 4 cellules/cm^{, 2} plaques de 10 cm. Cultivez les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 3 jours.
   6. Dissocier les cellules à 37 °C avec 0,25 % de trypsine-EDTA. Comptez et ensemencez les cellules dans des plaques de culture cellulaire à 24 puits avec cMEMα contenant 10 % de FBS et P/S à 7,5 × 10⁵/cm². Ensemencez au moins 4 puits par type de cellule et par substrat et au moins trois puits supplémentaires pour chaque type de cellule pour le comptage des cellules avant l’essai.
   7. Cultivez les cellules à 37 °C pendant la nuit avant les tests d’oxydation du substrat.
2. Isolement et culture des BMMs
   REMARQUE : La culture de BMM nécessite un facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF), qui peut être acheté dans le commerce sous forme de protéine recombinante. Le milieu conditionné de la lignée cellulaire CMG14-12 conçu pour exprimer le M-CSF est une alternative économique utilisée ici.
   1. Prélever des fémurs et des tibias de souris âgées de 8 semaines après avoir enlevé le muscle et les tissus conjonctifs. Coupez et jetez les deux extrémités des os avec des ciseaux bien aiguisés.
   2. Rincer la moelle osseuse d’un fémur et d’un tibia dans une boîte de Pétri de 10 cm à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de 23 G contenant 15 ml de cMEMα avec 10 % de FBS, P/S et 10 % de milieu conditionné CMG14-12 (milieu BMM). Cultivez les cellules dans la boîte de Pétri dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   3. Après 3 jours, jetez le milieu de culture et rincez-le avec du DPBS. Dissocier les cellules attachées à 37 °C avec 0,25 % de trypsine-EDTA pendant 5 min. Centrifugez et remettez en suspension la pastille de cellule dans le milieu BMM.
   4. Compter et ensemencer les cellules dans des plaques de culture cellulaire à 24 puits à 7,5 × 10⁵/cm² de la même manière que celle décrite à la section 3.1.6. Cultiver à 37 °C pendant une nuit dans le milieu BMM avant de commencer les essais.

4. Dosage de l’oxydation du substrat avec piège à_CO2

REMARQUE : Une densité de semis appropriée doit être déterminée pour chaque type de cellule afin d’atteindre une confluence de 80 à 90 % avant le début de l’essai. Notez que la densité cellulaire peut affecter l’état métabolique des cellules.

1. Lavez deux fois les cellules dans les puits supplémentaires avec du DPBS. Dissocier les cellules avec 0,25 % de trypsine-EDTA et mélanger 20 μL de cellules remises en suspension dans du DPBS avec 20 μL de solution de colorant commercial prête à l’emploi orange d’acridine et iodure de propidium (AO/PI). Déterminez le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et enregistrez le nombre pour les calculs finaux.
2. Lavez les cellules dans les puits de dosage deux fois avec du DPBS. Ajouter 500 μL de milieu chaud dans chaque puits d’essai dans le capot de culture tissulaire désigné par RAM. Scellez les plaques avec du parafilm et incubez les cellules dans un incubateur désigné par RAM à 37 °C pendant 4 h.
3. Pendant l’incubation, coupez le papier filtre en morceaux circulaires légèrement plus grands que la surface à l’intérieur du capuchon des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml et insérez le papier bien dans le capuchon (figure 1B). Ajouter 200 μL d’acide perchlorique 1 M dans chaque tube et 20 μL d’hydroxyde de sodium dans le papier filtre installé à l’intérieur du bouchon.
4. Après l’incubation des cellules, transférez 400 μL de milieu de culture de chaque puits dans les tubes préparés et fermez immédiatement les bouchons. Laissez les tubes dans un support à tubes à température ambiante pendant 1 h.
5. Pendant l’incubation, installez un flacon à scintillation pour chaque tube et remplissez-le de 4 mL de liquide à scintillation. Transférez chaque morceau de papier filtre dans un flacon à scintillation et incubez à température ambiante pendant 30 min.
6. Effectuez des tests d’essuyage sur le capot de culture tissulaire, le bain-marie (utilisé pour la préparation du ¹⁴C-oléate), le réfrigérateur, l’incubateur, l’évier, le sol et toute autre zone de travail pour détecter une contamination potentielle par RAM. Mettez les lingettes en papier dans des flacons à scintillation contenant du liquide à scintillation.
7. Mesurez la radioactivité du ¹⁴°C dans les flacons à scintillation à l’aide d’un compteur à scintillation. Enregistrez les résultats de lecture. Décontaminer l’environnement de travail conformément aux directives de radioprotection si nécessaire.

Résultats

Figure 1 : Diagrammes pour le dosage du piégeage du CO₂ et la dissection de la calvariose. (A) La région médiane de la calvaria, indiquée par le triangle pointillé orange, est récoltée pour l’isolement cellulaire. (B) Des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL sont utilisés pour le piégeage du CO₂ (étape 1). Des papiers-filtres (papier bl...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtres 0,22 μm	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Utilisé pour filtrer la solution BSA
0,25 % Trypsine-EDTA	Gibco	25200056	Dissocier les cellules de la culture cellulaire Plaques
Tubes Eppendorf de 1,5 ml	PR1MA	RP MCT17 RB	Utilisé pour l’incubation réactionnelle
Plaques de 10 cm	Le	Référence 93100	Utilisé pour la culture cellulaire
Seringue de 10 mL	Bd	302995	Utilisé pour rincer la moelle des < longs > os
10 % FBS	Produits biologiques d’Atlanta	S11550	Pour la préparation de milieux de culture cellulaire
14C -Glucose	PerkinElmer	NEC042X050UC	Utilisé pour faire des supports chauds
14 C-glutamine	PerkinElmer	NEC451050UC	Utilisé pour faire des supports chauds
14 C-oléate	PerkinElmer	NEC317050UC	Utilisé pour faire des supports chauds
Aiguille de 23 g	Bd	Référence 305120	Utilisé pour rincer la moelle des < longs > os
Plaques à 24 puits	Le	Référence 92024	Utilisé pour la culture cellulaire
Filtres à cellules de 70 μm	MIDSCI	70CELLULE	Utilisé pour filtrer le surnageant pendant digestion cavariale
Orange acridine/Iodure de propidium colorant (AO/PI)	Nexcelom Biosciences	Référence CS2-0106	Colore les cellules vivantes pour déterminer seed densité
Sérum Bovin Ablumin	Proliant Biologicals	Référence 68700	Utilisé pour la conjugaison des acides gras
Cellomètre Auto 2000	Nexcelom Biosciences		Déterminer le nombre de cellules viables
centrifugeuse	Thermo Fisher	Légende Micro 21R	Utilisé pour granuler les cellules
Collagénase de type II	Worthington	LS004176	Dissocier les cellules des tissus
Alpha MEM personnalisé	GIBCO	Réf. : ME 18459P1	Utilisé pour créer des médias chauds personnalisés
Tamponné au phosphate de Dulbecco Salin	Gibco	10010023	Utilisé pour dissoudre et diluer les réactifs et laver la vaisselle de culture
Papier filtre	Millipore-Sigma	WHA1001090	Piège le CO 2 avec de l’hydroxyde de sodium
glucose	Sigma-Aldrich	Référence G7528	Utilisé pour créer des médias personnalisés
HEPES	Gibco	15630080	Piège le CO 2 pendant la culture cellulaire
L-carnitine	Sigma-Aldrich	C0283	Supplémenté pour l’oxydation des acides gras
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	Référence G3126	Utilisé pour créer des médias personnalisés
MEM alpha	thermo	A10490	Milieu de culture cellulaire
Parafilm	Emballage en plastique Pecheney	Réf. PM998	Utilisé pour sceller les boîtes de culture cellulaire
Pénicilline-streptomycine	Thermo Fisher	15140122	Empêche la contamination lors de la culture cellulaire
Acide perchlorique	Sigma-Aldrich	244252	Libère du CO2 pendant le < métabolique > Test
Pyruvate	Sigma-Aldrich	p5280 (traduction libre)	Utilisé pour créer des médias personnalisés
Compteur à scintillation	Beckman Coulter	LS6500	Détermine la radioactivité à partir du papier filtre
Fluide à scintillation	MP Biomédical	882453	Absorber l’énergie émise par les RAMs et le réémettre sous forme d’éclairs de lumière
Flacon à scintillation	Fisher Scientific	Référence 03-337-1	Récipients de réaction pour scintillation fluide
carbonate de soude	Sigma-Aldrich	S5761	Tampon d’équilibre pour moyen
hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	Référence 58045	Piège le CO2 pendant le dosage du métaébullition
Oléate de sodium	Santa Cruz	SC-215879	Acide gras conjugué BSA préparation
Filtration sous vide 1000	Le	Référence 99950	Filtre cMEMα