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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE
1. Préparation de la LED pour l’éclairage à lumière bleue
- Allumez un panneau LED à l’aide de l’application associée installée sur une tablette/téléphone. Placez la sonde d’un spectromètre dans un puits vide d’une parabole à 6 puits et ajustez la lumière LED à la longueur d’onde culminant à ~456 nm à travers l’application. Placez le capteur optique d’un wattmètre optique dans le puits vide et ajustez la puissance de la lumière LED (~0,61 mW/cm2). Le réglage de l’éclairage LED peut être enregistré et peut être récupéré dans l’application.
- Introduisez le réglage de l’antenne/panneau LED dans l’incubateur à 28 °C. Terminez cette étape avant le début de l’imagerie des poissons à 48 hpf.
2. Imagerie des larves de poisson-zèbre exprimant l’optogénétique TDP-43
- Sélectionnez Tg[mnr2b-hs :opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs :EGFP-TDP-43z] poissons doublement transgéniques au moins avant 47 hpf, sur la base de la fluorescence RFP (opTDP-43h) ou EGFP (EGFP-TDP-43z) dans la colonne motrice spinale à l’aide du microscope à épifluorescence équipé d’une lentille d’objectif Plan-Neofluar 5x/0.15.
- Déchorionner le poisson double transgénique Tg[mnr2b-hs :opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs :EGFP-TDP-43z].
- Préchauffer à 42 °C une agarose à basse température de fusion contenant 250 μg/mL de sel de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate.
- Anesthésier brièvement les poissons doubles-transgéniques Tg[mnr2b-hs :opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs :EGFP-TDP-43] à 48 hpf dans un tampon E3 contenant la même concentration de Tricane.
- Mettez une goutte de l’agarose préchauffé à basse température de fusion de 1 % sur le plat à base en verre à température ambiante. Le diamètre de la goutte d’agarose en forme de dôme sur le plat en verre est de 8 à 10 mm.
- À l’aide d’une pipette Pasteur, ajoutez le poisson anesthésié à l’agarose à basse température de fusion sur le plat à base de verre, puis mélangez en pipetant plusieurs fois. Minimisez la quantité de tampon E3 ajoutée à l’agarose avec le poisson.
- Maintenez le poisson sur le côté à l’aide d’une aiguille de seringue pendant la solidification de l’agarose (généralement ~1 min) pour vous assurer que la moelle épinière est dans une position horizontale appropriée. Après la solidification, mettez quelques gouttes de tampon E3 sur le poisson monté sur l’agarose en forme de dôme.
- Acquérez des sections z confocales en série de la moelle épinière en numérisant avec un microscope confocal équipé d’une lentille d’objectif à immersion dans l’eau 20x avec une ouverture numérique de 1,00, en utilisant une vitesse de balayage de 4,0 μs par pixel (12 bits par pixel), une taille de pas de 1,0 μm par tranche pour l’objectif et une combinaison de longueurs d’onde d’excitation/émission : Canal 1) 473/510 nm pour EGFP et Canal 2) 559/583 nm pour mRFP1.
note: Le cloaque sur la face ventrale du poisson est inclus dans les régions d’intérêt (ROI) en tant que référence, ce qui aide à identifier et à comparer les segments de la colonne vertébrale (niveaux 16-17) à travers les points temporels.
- Retirez le poisson de l’agarose en cassant soigneusement l’agarose avec une aiguille de seringue dès que l’imagerie est terminée. Limitez autant que possible le temps pendant lequel le poisson est noyé dans l’agarose, bien que l’enrobage de l’agarose pendant <30 minutes n’affecte pas la viabilité du poisson.
3. Stimulation lumineuse des poissons exprimant l’opTDP-43h par l’éclairage sur le terrain d’une lumière à diode électroluminescente bleue (LED)
- Ajoutez 7,5 mL de tampon E3 dans le puits et placez le poisson double transgénique Tg[mnr2b-hs :opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs :EGFP-TDP-43z] imagé dans le puits. Placez l’antenne à six puits sur le panneau LED en gardant l’antenne et le panneau LED à 5 mm d’intervalle à l’aide d’une entretoise (par exemple, avec cinq verres à diapositives empilés).
- Allumez le voyant LED bleu. Conservez une partie du poisson double transgénique Tg[mnr2b-hs :opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs :EGFP-TDP-43z] dans une parabole séparée à six puits recouverte d’une feuille d’aluminium lorsque des poissons témoins non éclairés sont nécessaires (c.-à-d. dans des conditions sombres).
- Après l’illumination (p. ex., pendant 24 h à 72 hpf sur la figure 1), imagez la moelle épinière du poisson éclairé en répétant les étapes 2.3 à 2.9.
