Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE
1. Criblage in vitro de petites molécules
- Préparez les plaques de dosage en suivant les étapes ci-dessous.
- Versez de l’eau distillée autoclavée dans une auge stérile et, à l’aide d’une pipette multicanaux, versez 40 μL d’eau distillée de l’auge dans chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits.
- Préparez l’outil d’épinglage et ajoutez les produits chimiques.
- Installez des plateaux à broches (voir la table des matériaux) près d’une flamme de bec Bunsen sur une paillasse de laboratoire. Ajouter les éléments suivants dans les plateaux de pinner successifs : 25 mL de solution de nettoyage des broches, 35 mL de DMSO à 50 % (dans l’eau), 45 mL d’eau distillée, 55 mL d’EtOH à 70 % et 65 mL d’EtOH à 95 %. Placez une feuille de papier buvard devant chaque plateau.
- Nettoyez l’outil d’épinglage en emersant les goupilles dans la solution de nettoyage et en déplaçant les goupilles de haut en bas trois fois (3x) dans la solution. Dans ce protocole, « 3x » et « 10x » sont définis comme le déplacement de la broche vers le haut et vers le bas dans une solution trois ou dix fois, respectivement. Épongez les épingles sur le papier buvard. Répétez cette procédure une fois de plus.
- Ensuite, rincez les broches 3 fois à l’eau distillée, puis épongez les broches. Répétez la procédure une fois de plus.
- Enfin, rincez les broches 3 fois avec de l’EtOH à 95 %, puis épongez les broches. Répétez l’opération une fois de plus. Allumez la goupille et laissez l’éthanol s’évaporer.
- Ajoutez des produits chimiques à partir des plaques de stock de produits chimiques à 96 puits aux plaques de test en épinglant 3x dans la plaque chimique, puis en transférant les broches 10X dans la plaque de test. Épongez sur du papier devant la solution de nettoyage.
- Nettoyez l’outil d’épinglage entre les plaques en lavant dans l’ordre suivant, en épongeant entre les deux sur du papier buvard : 3x dans 50 % de DMSO (une fois), 3x dans de l’eau distillée (une fois), 3x dans 75 % d’EtOH (une fois), 3x dans 95 % d’EtOH (deux fois). Allumez la flamme de la broche et laissez l’éthanol s’évaporer.
- Répétez l’étape 1.2.2 lorsque tout l’épinglage est terminé.
note: Le criblage a été effectué à une concentration finale de 60 μM.
- Ajout de vers
- Comptez le nombre de nématodes de la collection en remettant d’abord en suspension, puis en pipetant 5 μL à l’aide d’embouts à faible rétention sur une lame à des fins d’observation. Comptez le nombre de nématodes dans 5 μL à l’aide d’un microscope de dissection.
- Ajustez la concentration à 2 vers/μL en utilisant de l’eau distillée stérile. À l’aide d’une pipette multicanaux et d’une auge, ajoutez 10 μL (~20 vers) dans chaque puits des plaques à 96 puits.
note: Environ 15 000 nématodes de D. dipsaci seront prélevés par plaque de culture en utilisant la méthode de culture et de collecte décrite. Vingt vers sont utilisés par puits, car le petit nombre facilite la visualisation et la comptabilisation claires des vers mobiles et immobiles.
- Scellez les plaques dans un film d’emballage de laboratoire et enveloppez-les avec un essuie-tout humide. Placer dans la boîte et fixer sur un tampon collant dans l’incubateur à agitation à 20°C réglé à 200 tr/min. Assurez-vous que les assiettes sont stabilisées dans la boîte en ajoutant une serviette en papier humide supplémentaire pour assurer un mouvement minimal des assiettes.
2. Collecte et analyse des données
- Observez les plaques le jour 5 sous un microscope à dissection. Comptez le nombre de mobiles et le nombre total de D. dipsaci dans les témoins de solvants DMSO et les puits traités par médicament.
- Si les vers sont relativement immobiles, ajouter 2 μL de 1 M de NaOH à une concentration finale de 40 mM dans le puits pour stimuler le mouvement.
note: Après avoir ajouté du NaOH, les vers se déplacent instantanément et doivent être visualisés dans les 5 minutes. Le nombre de vers mobiles et le nombre total de vers seront utilisés pour calculer la proportion de vers mobiles. La durée du test peut varier en fonction de l’objectif du dépistage.
- Calculez la proportion de vers mobiles. Dans les cribles de D. dipsaci, les puits qui ont donné de manière reproductible 0 % de vers mobiles sont classés comme des coups forts.
note: L’exposition prolongée des plaques sur la platine des microscopes de dissection est évitée car la source lumineuse peut chauffer les plaques et induire des effets variables sur l’essai biologique.
