Dosage de minéralisation in vitro : méthode colorimétrique pour quantifier les dépôts de calcium ostéoblastique sur un substitut de greffe osseuse par coloration et extraction au rouge d’alizarine

Résumé

Source : Kampleitner, C. et al. Profil de compatibilité biologique des biomatériaux pour la régénération osseuse. J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode de détection des dépôts de calcium sécrétés par les ostéoblastes à l’aide d’un colorant anionique, le rouge d’alizarine S. Les ostéoblastes cultivés sont d’abord colorés, puis le colorant est récupéré pour la quantification colorimétrique des dépôts de calcium ou du degré de minéralisation des ostéoblastes.

Protocole

1. Dosage de minéralisation des ostéoblastes

1. Pré-incuber des disques de phosphate β-tricalcique (β-TCP) de 14 mm de diamètre dans 1 mL de milieu de croissance osseuse (BGM) dans une plaque de culture en suspension à 24 puits à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h avant d’ajouter les ostéoblastes (OB). Utilisez des plaques de culture tissulaire standard pour les témoins et des plaques de culture en suspension pour les échantillons de biomatériaux afin d’éviter l’attachement des cellules au plastique.
2. Aspirez le milieu de pré-incubation, puis suspendez à nouveau les OB primaires de souris dans BGM. Ajouter 8,8 x 10⁴ OBs/cm² sur les disques β-TCP pré-incubés dans une plaque de culture en suspension à 24 puits et pour le groupe témoin, dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits (1 mL/puits). Les OB se fixeront à la plaque de culture tissulaire ou à l’échantillon de biomatériau.
3. Remplacer la BGM par 1 mL de milieu de minéralisation ostéogénique (MM) contenant de la BGM, 50 μg/mL d’acide ascorbique et 5 mM de β-glycérophosphate 24 h après l’ajout des OB et incuber pendant 14 jours à 37 °C et 5 % de CO₂. Changez le milieu tous les 2 à 3 jours avec 1 ml de MM fraîchement préparé dans chaque puits.

2. Minéralisation des ostéoblastes évaluée par coloration au rouge d’alizarine S (ARS)

1. Aspirer le milieu de culture des puits contenant les OB primaires 14 jours après l’ajout de MM et rincer deux fois avec 0,5 mL de 1x PBS à RT. Aspirer le PBS et fixer les cellules en ajoutant 0,5 mL de la solution de formol tamponnée à 10 % à RT pendant 10 min.
2. Aspirez le formol tamponné à 10 % à l’aide d’une pipette à usage unique et lavez-le deux fois avec 0,5 ml d’eau ultrapure.
3. Aux OB fixes, ajouter 0,25 mL de solution de coloration ARS 40 mM (pH 4,2) dissoute dans de l’eau ultrapure et incuber la plaque à RT pendant 10 min sur un agitateur à 100 shakes/min.
4. Aspirez la solution de coloration à l’aide d’une pipette à usage unique et rincez avec 1 mL d’eau ultrapure. Répétez cette étape 5 à 10 fois pour éliminer les taches non spécifiques.
   note: La solution de rinçage doit être sans couleur.
5. Aspirez l’eau ultrapure et ajoutez 1 mL de PBS froid. Incuber la plaque à RT pendant 10 min sur un shaker à 100 shakes/min.
6. Aspirez le PBS, transférez les disques β-TCP colorés dans un nouveau puits et scannez les plaques avec un scanner à plat pour enregistrer la minéralisation.
7. Ajouter 0,25 mL de solution de chlorure de cétylpyridinium à 10 % et incuber la plaque à RT pendant 15 min sur un agitateur à 100 secousses/min pour extraire le colorant ARS.
8. Transférez les surnageants dans un tube de 1,5 mL et centrifugez à 17 000 x g pendant 5 min à RT.
9. Ajouter une solution de chlorure de cétylpyridinium à 10 % aux extraits avec un rapport de dilution de 1:10 à 1:20 et ajouter les échantillons (300 μL) dans une plaque à 96 puits comprenant deux puits vierges contenant seulement 10 % de chlorure de cétylpyridinium.
10. Préparez 7 étalons de référence ARS allant de 4 à 400 μM en diluant la solution de coloration ARS 40 mM (pH 4,2) avec une solution de chlorure de cétylpyridinium à 10 % pour générer une courbe standard.
11. Ajouter 300 μL de l’étalon de référence en deux exemplaires à la plaque à 96 puits.
12. Lire l’absorbance des échantillons, des blancs et des étalons de référence à 520 nm.
13. Soustrayez les lectures à blanc des étalons de référence et des lectures d’échantillons.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Disques de phosphate β-tricalcique (β-TCP, 14 mm)			Les disques ont été frittés dans un four à moufle à une température de 1150 °C. Les échantillons ont été irradiés aux UV (15 min de chaque côté) avant d’être utilisés dans des cultures cellulaires
Rouge Alizarine S	Sigma-Aldrich	A5533
Milieu de croissance osseuse (BGM)			α-MEM + 10 % de FBS inactivé par la chaleur + 1 % de pénicilline/streptomycine
Solution de formol neutre tamponnée 10 %	Sigma-Aldrich	HT501128
Chlorure d’hexadécylpyrdinium (cétylpyridinium) monohydraté	Sigma-Aldrich	Réf. C9002
Acide L-ascorbique 2-phosphate sesquisel de magnésium hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
MEM alpha medium (α-MEM)	Gibco Life Technologies	Référence 11900-073
Milieu de minéralisation ostéogénique (MM)			α-MEM + 10 % de FBS inactivé thermiquement + 1 % de pénicilline-streptomycine + 50 μg/mL d’acide ascorbique + 5 mM de β-glycérophosphate
Pénicilline-streptomycine	Sigma-Aldrich	Réf. P4333
Solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
β-Glycérophosphate disodium hydrate	Sigma-Aldrich	Référence G5422
Eau ultrapure : Eau de culture cellulaire sans pyrogène	VWR	L0970-500
Plaque transparente à 96 puits	Greiner bio-one	655001
Plaque de culture en suspension à 24 puits	Greiner bio-one	662102
Plaque de culture tissulaire à 24 puits	Greiner bio-one	Référence 662160
Centrifugeuse : VWR Mega Star 600R	VWR
Incubateur à CO2 : HeraCell 240	Thermo Scientific
Scanner à plat : Epson Perfection 1200 Photo	Epson
Lecteur de microplaques Infinite M200 Pro	Técan
Tube de microcentrifugation : tube Eppendorf safe-lock 1,5 mL	VWR	Référence 21008-959
Incubateur à secousses GFL3032	GFL	Référence 3032
Pipette à usage unique : pipette à sérum	Greiner bio-one	612301