1. Préparation des billes pour l’implantation de gel
- Prenez une culture contenant des billes de microsupport enrobées de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) et de péricytes.
- Examinez les boîtes contenant les billes recouvertes de microsupports au microscope à l’aide de l’objectif 20X pour vous assurer que toutes les billes ont été suffisamment recouvertes de cellules endothéliales.
- Pipetez vigoureusement la solution plaquée de cellules pour les détacher de la plaque de 6 cm et placez la solution dans un tube. Lavez la plaque 2 fois de plus avec un support complet et transférez-la dans le tube pour recueillir toutes les billes résiduelles qui peuvent adhérer à la plaque.
- Évitez d’introduire des bulles d’air et utilisez une pipette p1000 pour minimiser la contrainte de cisaillement sur les billes recouvertes de cellules endothéliales.
- Attendez 3 min pour permettre aux billes de la solution de se déposer au fond du tube.
- Retirez autant de surnageant que possible sans déranger la bille à l’aide d’une pointe de pipette p1000 (n’utilisez pas d’aspirateur).
- Ajouter 1 mL de média complet dans chaque tube et remettre les billes en suspension.
- Attendez 30 à 60 s pour permettre aux billes de se déposer au fond. Ensuite, prélevez la plus grande quantité possible de surnageant à l’aide d’une pipette P1000 sans déranger la pastille de bille. N’utilisez pas d’aspirateur car la probabilité de retirer accidentellement la bille de bille est considérablement augmentée.
- Répétez les étapes 1.6 et 1.7 deux fois de plus. L’objectif est d’enlever autant que possible la partie du HUVEC flottant qui a pu être détachée de la plaque de 6 cm, tout en n’enlevant pas trop de billes recouvertes de HUVEC, qui devraient se déposer dans les tubes à fond rond FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) plus rapidement que les cellules flottantes.
- Ajouter 1 mL de support complet dans les billes.
2. Intégration de billes enrobées dans un gel de fibrine
- Retirez autant de support que possible sans déranger la pastille de bille dans chaque tube FACS à l’aide d’une pipette P1000.
- Remettre les billes en suspension dans 2,5 mL de solution de fibrinogène.
- Pipeter 13 μL de solution de thrombine dans chaque puits désiré d’une plaque à fond de verre à 24 puits. Le placage dans une plaque à fond de verre est essentiel pour permettre une imagerie optimale des germes.
REMARQUE : Ne laissez pas la thrombine dans un puits pendant plus de 5 à 10 minutes avant l’étape suivante.
- Ajouter 0,5 mL de solution de billes ou de fibrinogène dans chaque puits.
- Assurez-vous de bien suspendre la solution de billes avant de pipeter la solution à chaque fois.
- Prenez soin de pipeter soigneusement directement dans la thrombine déjà présente dans le puits. Pipetez lentement de haut en bas 2 à 3 fois pour bien mélanger la solution, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air.
- Assurez-vous de changer l’embout de la pipette entre les puits.
- Veillez à ne pas déplacer ou déranger la plaque à aucun moment pendant la coagulation initiale de la fibrine, car tout mouvement peut perturber la formation du gel.
- Laissez l’assiette reposer dans la hotte pendant 30 min à température ambiante.
- Transférez délicatement la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 1,5 à 2 h supplémentaires pour permettre au gel de se solidifier complètement
.
3. Placage de fibroblastes sur le gel de fibrine
- Au cours des 30 dernières minutes de solidification du gel, détachez les fibroblastes pulmonaires humains normaux (NHLF) comme suit :
- Laver une fiole T175 de cellules avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis ajouter 5 mL de solution de détachement cellulaire et incuber à 37 °C pendant 10 min.
- Remettre en suspension le NHLF à une concentration de 20 000 cellules/mL dans un milieu complet.
REMARQUE : Les cellules NHLF peuvent être cultivées avec du milieu Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline streptomycine.
- Déposer 1 mL de suspension cellulaire du NHLF sur le gel de chaque puits et le remettre dans l’incubateur.
- Changez de milieu complet tous les deux jours pendant la durée du dosage.
