1. Essai de contact larvaire (dose unique ou essai dose-réponse)
REMARQUE : L’essai peut être effectué avec des produits chimiques solubles dans l’eau ou dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), à condition que la concentration finale de DMSO dans les puits d’essai ne dépasse pas 1 %. D’autres solvants peuvent être une option, mais il est essentiel de confirmer d’abord que la concentration finale ne cause pas plus de 10 % de mortalité 72 heures après l’exposition. L’essai peut être effectué sous forme d’essai à dose unique ou d’essai dose-réponse. Si vous effectuez cette dernière opération, il est recommandé d’effectuer des tests dans une gamme de concentrations (minimum de cinq), couvrant la CL50 attendue.
- Étiquetez les puits d’une plaque de tissu transparente à 24 puits.
- Préparez une solution mère de la chimie d’essai dans un tube de 1,5 mL.
- Pesez chaque produit chimique à l’aide d’une balance analytique et, en fonction des caractéristiques de solubilité, mettez-le en suspension dans du ddH2O stérile, du DMSO ou un autre solvant organique approprié de votre choix.
note: Les calculs doivent tenir compte de la pureté de la chimie. Par exemple, pour une chimie pure à 99 %, dissoudre 10,1 mg dans 1 000 μL d’acétone pour obtenir une solution à 1 %. Fermer avec un film de paraffine et conserver à -20 °C.
- Déterminer la concentration finale de la chimie d’essai qui sera évaluée et préparer en conséquence les dilutions en série à partir de la solution mère à l’aide du solvant approprié.
note: La concentration et le volume de la chimie et du solvant peuvent être calculés à l’aide de la formule C1*V1=C2*V2 où C1=concentration de l’échantillon 1, C2=concentration de l’échantillon 2, V1=volume de l’échantillon 1 et V2=volume de l’échantillon 2.
- Préparer une solution mère de 10 mM et des dilutions en série au besoin pour obtenir les concentrations d’essai souhaitées (tableau 1B).
- À l’aide d’une pipette de transfert en plastique de gros calibre, transférez cinq larves L3 dans le puits d’une plaque d’essai de culture tissulaire ; Les larves L3 se reconnaissent par leur longueur (~ 2,5 - 3,5 mm) et la largeur de la capsule céphalique de ~ 0,025 mm. Prélever délicatement l’eau à l’aide d’une pipette de 1 mL et la remplacer par le volume désiré de ddH2O. Répéter l’opération pour obtenir n = 4 répétitions techniques par traitement (c’est-à-dire 20 larves au total par traitement).
- Ajoutez le volume approprié de chimie d’essai dans chacun des quatre puits répétés de la plaque d’essai à 24 puits et faites tourner doucement la plaque pour assurer un mélange uniforme de la chimie. Placer la plaque dans une chambre d’essai ou de culture dans des conditions constantes (p. ex., 25 °C et une HR de ~ 75 à 85 % sont recommandées, et un cycle de 12 h à la lumière et 12 h à l’obscurité si possible).
note: Pour la reproductibilité entre les expériences, assurez-vous que les tests ultérieurs sont effectués dans les mêmes conditions environnementales.
- Inscrivez le nombre de larves mortes ou non réactives dans chaque puits 30 min, 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 et 72 h après l’exposition (ou à d’autres moments) sur la feuille de pointage (tableau 2). Tapotez doucement le côté de l’assiette. Si aucun mouvement n’est observé, touchez doucement la larve avec un cure-dent stérile. Classer les larves qui ne réagissent pas au tapotement ou au toucher comme étant « mortes ».
note: D’autres phénotypes morphologiques et comportementaux peuvent être observés et enregistrés.
- Corriger la mortalité des témoins à l'aide de la formule d'Abbott modifiée si vous le souhaitez, comme suit :
Mortalité ( %) = (X-Y) *100/(100-Y),
où X = le pourcentage de mortalité dans l’échantillon traité, et Y = le pourcentage de mortalité dans le témoin.
- Représenter graphiquement les résultats sous forme d’histogramme ou de courbe logarithmique à l’aide d’un logiciel de votre choix, tel que Graph-pad, Prism 6 ou similaire, et calculer les valeurs de concentration létale (LC) par rapport au contrôle.
- Répétez le test en utilisant un lot séparé de moustiques pour obtenir n = 3 réplicats biologiques ou plus.
Table 1. Exemples de calculs pour l’essai de dose unique unique pour les larves d’Aedes aegypti L3 (A) et (B) pour l’essai dose-réponse.
| A. Dosages à dose unique avec trois chimies |
| chimie | Concentration (400 uM) |
| Amitriptyline | 80 mM Stock : 2 mg d’amitriptyline X 98 % (pureté de la poudre) X 0,001 g/1 mg X 1 mol /313,86 g X 1 L/0,08 mol X 106 μL/L = 78,06 μL d’eau. |
| Dilutions en série : Diluer la matière 1:2 avec ddH2O puis 1:4 pour obtenir 10 mM. Ajouter 40 μL de stock de 10 mM dans le puits contenant 960 μL de ddH20 pour obtenir une concentration finale de 400 μM/puits. Préparez des dilutions en série de 10 mM 1:2 pour obtenir des stocks de 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM et 0,625 mM. |
| Cis-(z)-flupenthixol | 80 mM Stock : 2 mg de cis(z)flupenthixol X 98 % (pureté de la poudre) X 0,001 g/1 mg X 1 mol/507,44 g cis(z)flupenthixol X 1L/0,08 mol X 106 μL/L = 48,28 μL d’eau. |
| Dilutions en série : Comme ci-dessus. |
| Amitraz | 80 mM Stock : 2 mg d’amitraz X 0,001 g/1 mg X 1 mol/293,4 g d’amitraze X 1 L/0,08 mol X 106 μL/1 L = 85,21 μL de DMSO (remarque : l’amitraze n’est soluble que dans le DMSO). |
| Dilutions en série : Comme ci-dessus. |
| B. Dosage dose-réponse |
| Chimie | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 |
| 400 μM | 200 μM | 100 μM | 50 μM | 25 μM |
| p. ex., Amitriptyline, cis-(Z)-flupenthixol oramitraz | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL |
| Stock de 10 mM | Stock de 5 mM | Stock de 2,5 mM | 1,25 mM de stock | 0,625 mM de stock |
Tableau 2. Exemple de feuille de pointage utilisée pour enregistrer les données de l’essai dose-réponse chez les larves de moustiques. Témoin, à l’eau seulement, ou à l’eau avec 1 % de DMSO ou un autre solvant seulement. Les doses typiques utilisées pour tester les chimies d’antagonistes de petites molécules telles que l’amitriptyline sont de 25 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM et 400 μM.
| Essai larvaire du Mosquito L3 |
| Date de lancement : |
| Enquêteur : |
| Espèce/Souche : |
| Type de dosage : Dose ponctuelle/dose-réponse |
- Mortalité (n° de moustiques morts)
| | |
| Temps (heures) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | contrôle |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| deux | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| 3 | | | | | | |
| 12 | | | | | | |
| 24 | | | | | | |
| 48 | | | | | | |
| 72 | | | | | | |
- Pourcentage de mortalité
|
| Temps (heures) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | contrôle |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| deux | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| 3 | | | | | | |
| 12 | | | | | | |
| 24 | | | | | | |
| 48 | | | | | | |
| 72 | | | | | | |
