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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE
1. Culture de moustiques adultes
REMARQUE : Des souches de moustiques sensibles aux insecticides sont disponibles dans le Malaria Research and Reagent Reference Repository. Les souches recommandées sont les suivantes : souche Aedes aegypti Liverpool (LVP), souche Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) et souche Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB).
- Élevage de larves de moustiques à partir d’œufs selon un cycle de 12 h de jour et 12 h de nuit à 28 °C et à 75-85 % d’humidité relative (HR) dans des plateaux en plastique de 25 cm x 40 cm (~ 400 larves par plateau) comme décrit par Nuss. Nourrissez les larves avec des gerbilles terrestres (A. aegypti et An. gambiae) ou de la nourriture pour poissons en flocons (C. quinquefasciatus). Pour les essais larvaires, prélever les larves au troisième stade larvaire (L3).
- Élever des moustiques adultes à partir de pupes qui ont été transférées dans des gobelets en plastique et les placer dans des cages en plastique de 20 L dans un insectarium dans les conditions décrites ci-dessus. Maintenez les moustiques avec une solution sucrée à 20 % comme décrit ailleurs. Prélever les adultes 3 à 5 jours après la levée.
2. Dosage topique chez l’adulte (dose ponctuelle ou dosage dose-réponse)
REMARQUE : Le dosage topique chez l’adulte est effectué à l’aide d’acétone comme solvant. D’autres solvants peuvent être une option, mais il est essentiel de confirmer d’abord que la concentration finale ne cause pas plus de 10 % de mortalité 48 heures après l’exposition. Le test peut être effectué sous forme de dose unique ou de test dose-réponse et est utilisé pour déterminer la dose létale (LD). Si vous effectuez cette dernière opération, il est recommandé de tester une gamme de concentrations (minimum de cinq), couvrant la DL50 attendue.
- Déterminer le nombre de moustiques femelles adultes nécessaires pour effectuer l’essai.
note: Un test à dose ponctuelle avec une seule chimie nécessitera un minimum de 90 moustiques (30 pour le témoin positif, 30 pour le contrôle négatif à l’acétone uniquement et 30 pour la chimie d’essai).
- Cultivez des moustiques femelles adultes âgées de 3 à 5 jours et placez-les dans un seau en plastique séparé de 20 ml à l’aide d’un aspirateur (figure 1).
- Étiquetez les gobelets en papier de 9 oz avec le nom et la concentration de la chimie d’essai. Mettez de côté des carrés en maille de 10 cm x 10 cm et des élastiques pour chaque tasse (voir la figure 2).
- Choisir un insecticide existant comme témoin positif (p. ex., pyréthrinoïde synthétique, bifenthrine) et préparer une solution mère à 1 % (10 μg/μL) dans de l’acétone.
REMARQUE : Les calculs doivent tenir compte de la pureté de la chimie. Par exemple, pour une chimie pure à 99 %, dissoudre 10,1 mg dans 1 000 μL d’acétone pour obtenir une solution à 1 %. Fermer avec un film de paraffine et conserver à -20 °C.
- En utilisant la même procédure que ci-dessus, préparer une solution mère de la chimie d’essai.
note: De nombreux tests chimiques sont très labiles, et les solutions doivent de préférence être fraîches chaque fois que l’essai biologique est effectué.
- Préparer des dilutions en série du témoin positif et tester les produits chimiques à partir de solutions mères, comme le montre la figure 3, en utilisant des flacons en verre de 20 mL préalablement rincés à l’acétone.
- Purgez une seringue en verre de 1 mL avec de l’acétone, remplissez-la d’acétone et fixez-la dans le micro-applicateur réglé pour délivrer un volume de 0,25 μL.
- En travaillant par groupes de dix, retirez les moustiques femelles adultes de 3 à 5 jours de leurs cages à l’aide d’un aspirateur et anesthésiez-les jusqu’à cinq minutes à 4 °C dans un réfrigérateur ou sur de la glace. Ensuite, transférez les moustiques dans une boîte de Pétri et placez-les sur de la glace jusqu’à 10 min.
- En travaillant rapidement, prélever une seule femelle à l’aide d’une pince à épiler fine et appliquer 0,25 μL de solution d’essai sur le thorax dorsal à l’aide du micro-applicateur à seringue. Confirmer l’administration de la chimie par observation à l’aide d’un microscope à dissection pour s’assurer que chaque moustique reçoit le volume approprié de chimie d’essai.
- Transférez le moustique dans un gobelet en papier étiqueté reposant sur de la glace, et répétez l’opération neuf fois pour obtenir n = 10 moustiques traités. Scellez les moustiques dans la tasse à l’aide d’un carré de maille fixé par un élastique et transférez-les dans un bac en plastique ou une chambre de croissance dans des conditions constantes de 28 °C et de 75 à 85 % d’humidité relative (sur un cycle de 12 h de jour et de 12 h de nuit, il est préférable).
- Répétez l’expérience ci-dessus deux fois pour obtenir n = 3 répétitions techniques (c’est-à-dire 30 moustiques au total) par groupe de traitement ou de contrôle.
- Répétez les étapes 2.7 à 2.10 en commençant par la chimie d’essai, puis avec le témoin positif.
note: Un autre contrôle utile à inclure si suffisamment de moustiques sont disponibles est un « blanc » de 30 moustiques anesthésiés qui ne reçoivent ni chimie de test ni solvant.
- Notez le nombre de moustiques « morts/non réactifs » à 30 min, 60 min, 2, 24 et 48 h après l’exposition (ou à d’autres moments) à l’aide de la feuille de pointage (tableau 1). Classez les moustiques comme « morts/non réactifs » s’ils montrent un manque de mouvement, c’est-à-dire qu’ils sont couchés sur le côté ou sur le dos et qu’ils sont incapables de voler.
- Si vous le souhaitez, corriger la mortalité des témoins à l'aide de la formule d'Abbott modifiée comme suit :
Mortalité ( %) = (X-Y) *100/(100-Y),
où X = le pourcentage de mortalité dans l’échantillon traité, et Y = le pourcentage de mortalité dans le témoin.
- Affichez les résultats sous forme d’histogramme ou de courbe exponentielle. Dans le cas d’un essai dose-réponse, calculer la valeur de la DL50, de la DL75 ou de la DL90 de la chimie d’essai par rapport au témoin.
- Répétez l’essai au moins deux fois en utilisant des lots distincts de moustiques pour obtenir n = 3 réplicats biologiques ou plus.
