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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Dosage de l’alimentation sanguine chez l’adulte (dosage ponctuel ou dosage réponse)
- Ramassez environ 150 moustiques femelles adultes âgés de 4 à 5 jours et transférez-les dans une cage séparée. Répéter l’opération pour obtenir 6 cages si vous effectuez un test dose-réponse. Retirez la source de sucre 1 à 24 h avant le test d’alimentation.
- Préparez une solution mère de chimie comme décrit ci-dessus, en tenant compte de la pureté de la chimie (une solution mère typique est de 80 mM dans de l’eau ou un tampon salin), puis préparez des dilutions en série dans l’eau/le tampon au besoin.
- Ajouter 40 μL de chacune des dilutions à 960 μL de sang de lapin défibriné pour obtenir la concentration d’essai souhaitée. Appliquez un film membranaire sur une unité d’alimentation et scellez-le avec un anneau en caoutchouc. Transférez 1 mL de sang à l’aide d’une pipette et fixez l’unité d’alimentation à une unité de chauffage.
- Tamponnez doucement la surface de la membrane avec une solution d’acide lactique à 10 % fraîchement préparée et placez l’unité d’alimentation dans la cage des moustiques adultes. Couvrez la cage avec un chiffon foncé ou un sac poubelle noir et laissez les moustiques se nourrir pendant une heure.
- Répéter les étapes 1.2 à 1.4 pour le reste des solutions d’essai et le témoin négatif (sang seulement).
- Une fois le repas terminé, placez les seaux à 4 °C dans un réfrigérateur pendant 5 min pour anesthésier les moustiques. Éliminez les moustiques mâles et les moustiques femelles non nourris, et comptez et enregistrez le nombre total de moustiques nourris et partiellement nourris en examinant l’abdomen.
- Retenir les moustiques femelles partiellement et entièrement nourris, en visant un minimum de 50 moustiques nourris au sang par dose.
- Transvaser les seaux dans une cuve en plastique ou une chambre de croissance dans des conditions constantes de 28 °C et de 75 à 85 % d’humidité relative (sur un cycle de 12 h de jour et de 12 h de nuit, il est préférable).
- Consignez le nombre total de moustiques morts ou non réactifs à 0,5, 1, 1,5, 2, 24, 48 et 72 h (ou à d’autres moments si désiré) à l’aide de la feuille de pointage (tableau 1).
- Le troisième jour après l’alimentation sanguine, introduisez un coquetier dans la cage et recueillez les œufs sur une période de 72 heures. Comptez le nombre total d’ovules produits par traitement à l’aide d’un microscope à dissection.
- Calculez le pourcentage de mortalité et de fécondité en fonction du nombre total de moustiques nourris pour chaque groupe de traitement et le groupe témoin. Corriger la mortalité des témoins à l'aide de la formule d'Abbott modifiée si désiré.
- Affichez les données de toxicité et de fécondité sous forme de graphique d’histogramme ou de courbe exponentielle (si vous effectuez un test dose-réponse) à l’aide du logiciel de votre choix. Si vous effectuez un essai dose-réponse, calculer la valeur de la DL50, de la DL75 ou de la DL90 pour la chimie d’essai par rapport au témoin.
- Répétez l’essai au moins deux fois en utilisant des lots distincts de moustiques pour obtenir n = 3 réplicats biologiques ou plus.
Table 1. Exemple de feuille de pointage utilisée pour enregistrer les données de l’essai d’alimentation sanguine chez l’adulte.Les doses typiques utilisées pour tester les chimies d’antagonistes de petites molécules telles que l’amitriptyline sont de 50 μM, 100 μM, 200 μM et 400 μM.
| Moustique adulte (3-5 jours) Dosage topique |
| Date de lancement : |
| Enquêteur : |
| Espèce/Souche : |
| Type de dosage : Dose ponctuelle/dose-réponse |
| A. Mortalité (n° de moustiques morts) |
| Temps (heures) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | contrôle |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| deux | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| B. Pourcentage de mortalité |
| Temps (heures) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | contrôle |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| deux | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |