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1. Production de lentivirus
REMARQUE : La production et la manipulation de vecteurs lentiviraux ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) pour la recherche impliquant de l’ADN recombinant. Le plasmide codant pour le mutant de type sauvage SOD1 et A4V marqué avec YFP amélioré (SOD1WT-YFP et SOD1A4V-YFP) est utilisé. Les deux produits de fusion génique ont été amplifiés à l’aide de la paire d’amorces PCR 5'-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3′ et 5′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCCTCCATGCC-3′ et insérés dans le plasmide CMV pTRIP-delta U3 à l’aide des sites de restriction XhoI et BsrGI. L’évitement de plus de 20 passages et le maintien des cellules à moins de 60 % de confluence permettent d’assurer une bonne efficacité de transfection.
- Le jour 1, divisez les cellules HEK-293T à 30 - 40 % de confluence dans une plaque de culture tissulaire de 10 cm de diamètre (3 x 10⁶ cellules/boîte) dans 10 mL de milieu de culture cellulaire (DMEM à haute teneur en glucose avec 10 % de FBS et 4 mM de L-glutamine) pour la production de virus.
- Conservez la plaque de culture tissulaire de 10 cm de diamètre dans un incubateur à CO₂ (37 °C, 5 % CO₂) pendant la nuit.
- Le jour 2, préparer une solution de transfection d’ADN contenant 10 μg de vecteurs lentiviraux (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP ou -SOD1A4V-YFP) ainsi que les plasmides d’emballage lentiviral (5 μg de pVSVg ; 10 μg de pCMV-dR8.71) (Figure 1A). Ajouter 125 μL de 1 M de CaCl₂ et ajuster le volume à 500 μL avec de l’eau distillée. Ajouter délicatement 500 μL de 0,05 M HEPES dans le mélange et incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Remplacer le milieu de cellules HEK-293T par un milieu de culture frais préchauffé de 10 mL, sans antibiotique mélangé à 1 mL de solution de transfection d’ADN, et incuber pendant la nuit à 37 °C, 5 % de CO₂.
- Le jour 3, remplacer le surnageant cellulaire par un milieu de culture frais.
- Le jour 4, récoltez le surnageant dans un tube de 15 mL et centrifugez-le pendant 5 min à 500 x g pour éliminer les cellules mortes et les débris. Purifiez davantage le surnageant en le faisant passer à travers un filtre de 0,45 μm à l’aide d’une grande seringue de 60 ml. Verser immédiatement dans des aliquotes à usage unique (300 μL) et conserver à -80 °C. Pour maintenir une activité maximale du produit, évitez un cycle de gel-dégel.
2. Transduction lentivirale
- Divisez la lignée cellulaire à infecter à 60 % de confluence (cellules HEK-293 et SH-SY5Y ; 5 cellules de 10 cellules par puits et U2OS ; 1 cellule de 10 cellules par puits) dans une plaque de culture tissulaire de 6 puits dans 2 ml de milieu DMEM complété par 10 % de FBS.
- Conservez la plaque de culture tissulaire à 6 puits dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO₂ pendant la nuit.
- Retirer le lentivirus congelé du congélateur à -80 °C et décongeler une aliquote sur de la glace avant chaque utilisation ; ne pas recongeler.
- Pendant que le virus dégèle, réchauffez le milieu de culture cellulaire contenant le sérum compatible avec la lignée cellulaire d’intérêt. Une fois le virus complètement décongelé, préparez une gamme de dilutions (1:3, 1:10, 1:30 et 1:100) dans du DMEM dans un tube de microfuge frais de 1,5 ml.
- Augmentez le volume dans les tubes à 1 mL avec un milieu sérique réduit.
- Ajouter 2 μL de Polybrene (à raison d’une quantité de 4 μg/μL) à 1 mL de virus/milieu. Bien mélanger par pipetage et ajouter 1 mL de mélange dans les cellules. Incuber les cellules avec le virus pendant 24 h.
- Retirez le support de virus et remplacez-le par un support DMEM normal complété par 10 % de FBS. Maintenez les cellules à 37 °C, 5 % CO₂.
- Surveillez la croissance des cellules et changez le milieu de culture tous les deux jours. À la confluence, étendre la boîte à 6 puits en une plaque de culture tissulaire de 10 cm de diamètre.
- Une fois que les cellules ont été suffisamment développées, ensemencer 1,5 x 10⁴ cellules par puits dans 50 μL de milieu DMEM sur des plaques de dosage à 384 puits pour vérifier le niveau d’expression de la protéine marquée YFP par microscopie. Si l’expression cellulaire de la protéine marquée YFP présente un rapport signal/bruit ≥3, préparez le stock cellulaire pour la lignée cellulaire correspondante.
3. Effet dépendant du temps de l’inhibiteur du protéasome sur l’agrégation des protéines
REMARQUE : Effectuez l’acquisition d’images à l’aide d’un microscope automatisé (voir Matériaux).
- Distribuer 0,25 μL de DMSO ou d’inhibiteur de protéasome dissous dans du DMSO à 100 % (ALLN, 2 mM) sur des plaques à fond plat de 384 puits.
- Ensemencez manuellement 1,5 x 104 cellules par puits dans 50 μL de milieu DMEM sur la même plaque de test. La concentration finale de l’inhibiteur du protéasome (ALLN) doit être de 10 μM.
- Réglez l’unité de contrôle de l’environnement du système de microscope à 37 °C et 5 % de CO₂. Une capture d’écran de l’installation expérimentale est illustrée à la figure 2.
- Faites fonctionner le microscope en mode fluorescence grand champ, à l’aide du logiciel avec les paramètres suivants : objectif LWD 20X, mode non confocal, 4 champs/puits, avec un intervalle de capture d’une heure. À la fin de chaque exécution, les images capturées sont automatiquement téléchargées sur le serveur.
4. Imagerie en accéléré pour l’expression de YFP dans les cellules vivantes et analyse d’images (canal unique)
REMARQUE : Les étapes suivantes décrivent l’application du logiciel (par exemple, Columbus).
- Sélectionnez l’algorithme approprié pour segmenter les objets primaires (cytosol et agrégats). Si nécessaire, ajustez le seuil d’arrière-plan et les paramètres de contraste (Figure 3).
- Comptez les cellules à l'aide de l'option « Trouver des cellules » avec un seuil individuel de 0,1 pour le canal d'intensité YFP. Déterminez les agrégats à l'aide d'un algorithme de « recherche de points » avec une intensité de spot YFP relative de >0,2 et un coefficient de fractionnement de 1,0.
5. Effet dose-réponse des inhibiteurs de protéasome sur l’agrégation des protéines sur des cellules vivantes colorées pour leurs noyaux (deux canaux)
REMARQUE : Effectuez l’acquisition d’images à l’aide d’un microscope automatisé. Déterminer la plage de concentration des inhibiteurs du protéasome (ALLN, époxomicine et MG132) en fonction de la valeur IC50 attendue pour assurer un ajustement optimal de la courbe.
- Préparer des dilutions en série de composés sur une plaque de polypropylène de stockage de 384 puits selon la série de dilution standard 1:3. Assurez-vous de bien mélanger les dilutions du composé pour vous assurer que les concentrations du composé sont exactes.
- Distribuer 0,25 μL d’inhibiteurs du protéasome sur des plaques de dosage noires à 384 puits à fond plat vides. Nous utilisons un manipulateur de liquides équipé d’une tête capillaire de 384 capable de transférer des volumes.
- Amorcez 1,5 x 1010⁴ cellules par puits dans 50 μL de milieu DMEM sur des plaques de test. Incuber les plaques de dosage à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h.
- Ajouter 10 μL de média DMEM (préchauffé à 37 °C) avec une solution de coloration (Hoechst 33342 à 10 mg/mL) et incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Lancez le logiciel d’exploitation du microscope. Une capture d’écran de la configuration expérimentale est illustrée à la figure 4. Sélectionnez l’onglet « Configuration » et sélectionnez l’objectif 20X et le bon type de plaque. Assurez-vous que le « collier » est réglé sur la bonne valeur sur l’objectif, ce qui permet une mise au point correcte avec différents types de plaques.
- Sélectionnez l’onglet « Microscope ». Définissez l’exposition 1 comme YFP (laser 488) et l’exposition 2 comme Hoechst (laser 405). Activez le filtre sur les deux expositions et attribuez l’exposition 1 à l’appareil photo 1 et l’exposition 2 à l’appareil photo 2. Réglez les temps d’exposition sur ~800 ms pour l’exposition 1 et ~40 ms pour l’exposition 2.
- Sélectionnez l’exposition 1. Réglez la hauteur de mise au point sur 0 μm. Sélectionnez « Mise au point ». Une fois la mise au point effectuée, exposez l’appareil photo 1. Ajustez la hauteur de mise au point pour optimiser le plan d’exposition et cliquez sur « Prendre de la hauteur ». Modifiez les temps d’exposition et la puissance du laser pour donner une intensité de pixel maximale de ~3 000. Enregistrez les paramètres d’exposition. Répétez l’opération pour l’exposition 2.
- Sélectionnez l’onglet « Définition de l’expérience ». Créez une mise en page et une sous-mise en page. Faites glisser et déposez la mise en page, l’exposition, l’image de référence, le fichier d’affleurement et la sous-mise en page appropriés. Enregistrez l’expérience.
- Sélectionnez l’onglet « Expérience automatique » et acquérez des images. À la fin de chaque exécution, les images capturées sont automatiquement téléchargées sur le serveur.
6. Analyse d’images de deux canaux
- Sélectionnez l’algorithme logiciel pour segmenter les objets primaires (noyaux, cytosol et agrégats) (Figure 5).
- Sélectionnez la méthode qui segmente les noyaux avec précision par inspection visuelle des objets segmentés. Les objets colorés de Hoechst dans le canal 1 (Ch1) seront utilisés pour déterminer le nombre de cellules. La coloration YFP du mutant SOD1-A4V dans le canal 2 (Ch2) sera utilisée pour déterminer la quantité d’agrégats.
- Comptez les cellules à l'aide de l'algorithme « trouver les noyaux » en tant que régions de coloration de Hoechst >20 μm², avec un facteur de division de 7,0, un seuil individuel de 0,40 et un contraste >0,10.
- Créez le tableau de données et déterminez la CE50 pour chacun des composés à l'aide de l'équation de « régression non linéaire » du logiciel de représentation graphique.
