Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Dosage de l’activité des endotoxines (EAA)
- Prélever des échantillons de sang du patient dans des tubes stériles contenant l’anticoagulant EDTA. Conservez les échantillons de sang à température ambiante
- Préparez les tubes à essai EA pour chaque échantillon de sang de patient que vous devez tester. Mettez les tubes dans des supports de tubes. Retirez ensuite les bouchons.
- Chaque test EA se compose de 5 types de tubes différents ; utilisez chacun pour une partie différente du test (reportez-vous aux étapes suivantes).
- Utilisez le tube #1 (le tube « contrôle ») pour mesurer l'activité basale de l'explosion oxydative non spécifique des neutrophiles du patient en l'absence d'un anticorps spécifique.
- Utilisez le tube #2 (le tube « d’échantillon ») pour mesurer le sursaut oxydatif en réponse au complexe lipopolysaccharidique-anticorps (LPS).
- Utilisez le tube #3 (le tube « Max ») pour mesurer l'explosion oxydative maximale des neutrophiles du patient en réponse à un excès d'endotoxine.
- Utilisez le tube #4 (le tube « LPS ») comme source d’endotoxine exogène.
- Utilisez le tube #5 (tube « Aliquote ») pour le stockage du sang.
REMARQUE : Des doublons des tubes #1, #2 et #3 sont fournis pour un total de 8 tubes à utiliser pour chaque échantillon de sang analysé (le flacon de réactif EA et le test de contrôle de la qualité peuvent être utilisés pour tous les tests contenus dans un sachet).
- À l’aide d’une pipette combinée, pipetez un volume de 1 mL du réactif EA de la bouteille dans les tubes #1 (tube de contrôle), #2 (tube d’échantillon) et #3 (tube Max), chacun en duplicate.
REMARQUE : Pipette sur le côté du tube pour éviter que la solution ne remonte.
- Mélangez l’échantillon de sang du patient en inversant doucement le tube de prélèvement sanguin 20 fois. Ensuite, pipetez 0,5 mL de sang du patient dans le tube #4 (tube LPS max) et le tube #5 (tube Aliquote). Tube vortex #4 pendant 10 s.
- Placez les portoirs de tubes avec tous les tubes à essai EA dans l’agitateur de l’incubateur. Fermez le couvercle et laissez incuber pendant 10 min à la température de 37°C.
- Ouvrez le couvercle et retirez les supports de tubes de l’agitateur de l’incubateur. Tube Vortex #5 (tube Aliquote). À l’aide d’un embout stérile, pipeter 40 μL de sang dans les tubes #1 et #2, en double.
- Tube Vortex #4 (tube LPS). À l’aide de la même pointe de pipette, pipeter 40 μL de sang du tube #4 dans le tube #3 (tube Max), en double.
- Vortex les six tubes à essai finaux (#1, #2, #3 et les duplicatas respectifs), puis remettez-les dans leurs racks.
REMARQUE : Assurez-vous que tous les tubes sont vortex pendant la même durée.
- Remettez les grilles à tubes dans l’agitateur d’incubation et fermez le couvercle. Réglez l’agitateur d’incubation à 100 tr/min, puis démarrez le mouvement pendant 14 min.
- Insérez la carte à puce étiquetée EA dans le chimiluminomètre et appuyez sur Démarrer. Après l’incubation de 14 minutes, suivez les instructions affichées sur le chimiluminomètre pour lire les tubes EA dans le bon ordre.
- Agitez doucement chaque tube pendant 10 secondes avant de le placer sur le porte-échantillon du chimiluminomètre. Ouvrez le tiroir à échantillons et placez le tube #1 dans le porte-échantillon. Ensuite, fermez le tiroir à échantillons et attendez la lecture de l’unité de lumière relative (RLU).
- Répétez l’étape 1.12 pour le tube 2 et le tube 3.
- Répétez l’étape 1.12 pour les tubes 1, 2 et 3.
note: Essayez de vortex tous les tubes pendant la même durée pendant les étapes 1.12 à 1.14.
- Une fois que tous les tubes ont été traités, notez que les résultats EA seront calculés et imprimés automatiquement. Les niveaux sont exprimés en unités EA et représentent la moyenne des déterminations en double à partir des mêmes échantillons.
- Répétez les étapes 1.4 à 1.15 pour chaque échantillon de sang qui doit être analysé.
- Une fois le test terminé, conservez les tubes à essai et les réactifs EA restants à une température de 2 à 8 °C pendant 30 jours maximum.
