Dosage turbidimétrique du lysat d’amibocytes Limulus : une technique pour détecter et quantifier la contamination par les endotoxines dans les médicaments nanoformulés

Résumé

Source : Neun, B. W. et al., Détection d’endotoxines dans des nano-formulations à l’aide de dosages de lysat d’amibocytes de Limulus (LAL). J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo décrit le format turbidimétrique du test de lysat d’amibocytes de Limulus, ou LAL, pour estimer la contamination par les endotoxines dans les nano-formulations de doxorubicine liposomale pégylée. La turbidité de la solution suite à la réaction de l’endotoxine avec le réactif LAL permet d’estimer l’endotoxine dans l’échantillon.

Protocole

1. Préparation des échantillons de nanoparticules

1. Préparez l’échantillon d’étude dans de l’eau de qualité LAL.
2. Si le pH de l’échantillon se situe en dehors de la plage de 6 à 8, ajustez le pH en utilisant de l’hydroxyde de sodium apyrogène ou de l’acide chlorhydrique.
3. À l’aide d’eau de qualité LAL, préparez plusieurs dilutions de l’échantillon d’étude. Assurez-vous que la dilution la plus élevée ne dépasse pas la dilution maximale valide (MVD).

2. Préparation des réactifs communs entre les formats LAL

1. Diluer le stock concentré d’hydroxyde de sodium à l’aide d’eau réactive LAL apyrogène pour préparer une solution de travail à une concentration de 0,1 N.
2. Diluer un bouillon concentré d’acide chlorhydrique à l’aide d’eau réactive LAL apyrogène et préparer une solution de travail à une concentration finale de 0,1 N.
3. Préparation de l’étalon de contrôle des endotoxines (CSE)
   1. Reconstituer le CSE selon le certificat d’analyse fourni par le fabricant.
      note: Reportez-vous à la table des matériaux pour plus de détails concernant le numéro de catalogue et l’application d’une formulation CSE donnée dans différents formats de LAL.
4. Préparation du réactif LAL
   1. Reconstituer le réactif LAL selon le certificat d’analyse fourni par le fabricant.
      note: Reportez-vous à la table des matériaux pour plus de détails concernant le numéro de catalogue et l’application d’une formulation de réactif LAL donnée dans différents formats LAL.

3. Dosage de la turbidité LAL

1. Préparation des étalons d’étalonnage
   1. À l’aide de 900 μL d’eau de qualité LAL et de 100 μL de CSE, préparer autant de dilutions intermédiaires que nécessaire pour permettre la préparation d’un étalon d’étalonnage avec une plage de concentration de 0,001 à 1 UE/mL.
   2. Étiquetez d’abord les tubes et ajoutez 900 μL d’eau de qualité LAL dans chaque tube. Ajouter ensuite 100 μL de solution à 10 EU/mL pour préparer l’étalon avec une concentration de 1EU/mL.
   3. Répétez la dilution 10 fois en série comme décrit ci-dessus pour préparer trois étalons d’étalonnage inférieurs. Vérifiez que quatre étalons d’étalonnage allant de 0,001 à 1 UE/ml ont été préparés.
2. Préparation des contrôles qualité
   1. Préparez un contrôle de qualité de 0,05 UE/ml en combinant 50 μL de la solution CSE 1 UE/ml avec 950 μL d’eau de qualité LAL.
3. Préparation des contrôles d’inhibition/d’amélioration (IEC)
   1. Préparer la CEI à une concentration de 0,05 UE/mL en combinant 25 μL de la solution CSE 1 UE/mL et 475 μL du nanomatériau d’essai à une dilution donnée.
4. Procédure expérimentale
   1. Laissez l’instrument se réchauffer en l’allumant environ 30 minutes à l’avance. Réglez la longueur d’onde de détection à 660 nm en fonction de la turbidité LAL.
   2. Connectez-vous en tapant le nom d’utilisateur et le mot de passe.
   3. Ouvrez le logiciel (Table des matériaux) en cliquant sur l’icône correspondante sur un écran d’ordinateur.
   4. Sélectionnez Collecter des données sur l’écran d’accueil du logiciel. Entrez l’ID de test et les informations du groupe de données dans l’espace correspondant de l’onglet Général de l’écran d’accueil.
   5. Cliquez sur l’onglet Matériel. Choisissez le type d’instrument dans un menu déroulant.
   6. Réglez la longueur d’onde de détection à 660 nm car elle convient à la turbidité LAL en choisissant la méthode de turbidité LAL.
   7. Vérifiez qu’un numéro de série, un ID système et des informations sur le port série s’affichent à l’écran. Cliquez sur OK. Cliquez une fois de plus sur OK pour confirmer.
   8. Entrez l’ID de l’échantillon dans le même ordre que celui dans lequel l’échantillon est testé. Utilisez les boutons par défaut pour saisir le contrôle négatif, la courbe standard et les échantillons de test.
   9. Préparez des tubes en double pour chaque échantillon et ajoutez 200 μL (rapport de test 4:1) ou 100 μL (rapport de test 1:1) de contrôle négatif (eau), d’étalons d’étalonnage, de contrôle de la qualité, d’IEC et de nanoparticules de test dans des tubes en verre pré-étiquetés.
   10. Ajoutez 50 μL (rapport de test 4:1) ou 100 μL (rapport de test 1:1) de réactif LAL dans le premier flacon de test, agitez-le brièvement et insérez-le dans la fente de test du carrousel de l’instrument. Si le rapport 1:1 est utilisé, le volume du réactif LAL est de 100 μL.
   11. Répétez la procédure décrite ci-dessus pour d’autres échantillons. Traitez les échantillons un par un.
        

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
hydroxyde de sodium	sigma	S2770	Si nécessaire, il est utilisé pour ajuster le pH de l’échantillon entre 6 et 8
acide chlorhydrique	sigma	N° H9892	Si nécessaire, il est utilisé pour ajuster le pH de l’échantillon entre 6 et 8
Réactif LAL	Associés de Cape Cod	Réf. T0051	Ce réactif ne peut être utilisé qu’avec un dosage de la turbidité
Norme de contrôle des endotoxines	Associés de Cape Cod	E0005	Ce réactif peut être utilisé avec des dosages de turbidité et de caillot de gel
Eau de qualité LAL	Associés de Cape Cod	Réf. WP0501	Ce réactif peut être utilisé avec n’importe quel format LAL
Tampon Glucashield	Associés de Cape Cod	Référence : GB051-25	Utilisé pour prévenir les réponses faussement positives des bêta-glucanes
Tubes de dilution en verre jetables sans endotoxines 12 x 75 mm	Associés de Cape Cod	TB240	Ces tubes peuvent être utilisés avec les trois tests
Tubes réactionnels en verre jetables sans endotoxines 8 x 75 mm	Associés de Cape Cod	TK100	Ces tubes peuvent être utilisés avec des tests de turbidité et chromogènes
Embouts apyrogènes avec des volumes de 0,25 et 1,0 mL	RAININ	PPT25, PPT10	Les pointes et les pipettes peuvent adsorber l’endotoxine et libérer des substances lixiviables qui interfèrent avec le dosage de la LAL. Ces pointes RAININ sont utilisées parce que leur performance optimale dans le test LAL a été vérifiée et confirmée
Tubes de microcentrifugation apyrogènes, 2,0 mL	Eppendorf	22600044	D’autres fournitures équivalentes peuvent être utilisées
Pyrogen-fee combitips, 5mL	Eppendorf	30089669	D’autres fournitures équivalentes peuvent être utilisées
Pipette à répétition	Eppendorf	4982000020	D’autres fournitures équivalentes peuvent être utilisées
Microcétrifuge	n’importe quelle marque		Toutes les marques peuvent être utilisées
Réfrigérateur, 2-8 °C	n’importe quelle marque		Toutes les marques peuvent être utilisées
tourbillon	n’importe quelle marque		Toutes les marques peuvent être utilisées
Congélateur, -20 C	n’importe quelle marque		Toutes les marques peuvent être utilisées
Lecteur Pyros Kinetix ou Pyros Kinetix Flex	Associés de Cape Cod	Réf. PKF96	D’autres instruments peuvent être utilisés. Cependant, les réactifs LAL et les étalons d’endotoxines utilisés dans cet essai peuvent nécessiter une optimisation. Lorsque d’autres instruments sont utilisés, veuillez vous référer aux fabricants de l’instrument et du kit LAL pour obtenir des instructions