Dosage du lysat d’amibocytes Gel-Caillot Limulus : une méthode de détection d’endotoxines bactériennes dans des formulations de nanoparticules

Résumé

Source : Neun, B. W. et al., Détection d’endotoxines dans les nano-formulations à l’aide de dosages de lysat d’amibocytes de Limulus (LAL). J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit un test de caillot de gel pour déterminer la présence d’endotoxines bactériennes dans des nano-formulations à l’aide de lysat d’amibocytes Limulus dérivé des cellules sanguines de limules. Le test permet de tester la contamination par les endotoxines des produits pharmaceutiques, y compris les formulations nano-dérivées.

Protocole

1. Préparation des échantillons de nanoparticules

1. Préparez l’échantillon d’étude dans de l’eau de qualité LAL.
2. Si le pH de l’échantillon se situe en dehors de la plage de 6 à 8, ajustez le pH en utilisant de l’hydroxyde de sodium apyrogène ou de l’acide chlorhydrique.
3. À l’aide d’eau de qualité LAL, préparez plusieurs dilutions de l’échantillon d’étude. Assurez-vous que la dilution la plus élevée ne dépasse pas la dilution maximale valide (MVD).

2. Préparation des réactifs communs entre les formats LAL

1. Diluer le stock concentré d’hydroxyde de sodium à l’aide d’eau réactive LAL apyrogène pour....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif LAL	Associés de Cape Cod	G5003	Ce réactif est spécifique au dosage du caillot de gel
Étalon de contrôle des endotoxines	Associés de Cape Cod	E0005	Ce réactif peut être utilisé avec des tests de turbidité et de caillot de gel
hydroxyde de sodium	sigma	S2770	Si nécessaire, il est utilisé pour ajuster le pH de l’échantillon entre 6 et 8
acide chlorhydrique	sigma	N° H9892	Si nécessaire, il est utilisé pour ajuster le pH de l’échantillon entre 6 et 8
Eau de qualité LAL	Associés de Cape Cod	Réf. WP0501	Ce réactif peut être utilisé avec n’importe quel format LAL
Tampon Glucashield	Associés de Cape Cod	Référence : GB051-25	Utilisé pour prévenir les réponses faussement positives des bêta-glucanes
Tubes de dilution en verre jetables sans endotoxines 12 x 75 mm	Associés de Cape Cod	TB240	Ces tubes peuvent être utilisés avec les trois tests
Tubes réactionnels en verre jetables sans endotoxines 10 x 75 mm	Associés de Cape Cod	TS050	Ces tubes sont destinés à être utilisés avec le dosage du caillot de gel
Embouts apyrogènes d’un volume de 0,25 et 1 mL	RAININ	PPT25, PPT10	Les pointes et les pipettes peuvent adsorber l’endotoxine et libérer des substances lixiviables qui interfèrent avec le dosage de la LAL. Ces pointes RAININ sont utilisées parce que leur performance optimale dans le test LAL a été vérifiée et confirmée
Tubes de microcentrifugation apyrogènes, 2,0 mL	Eppendorf	22600044	D’autres fournitures équivalentes peuvent être utilisées
Pyrogen-fee combitips, 5mL	Eppendorf	30089669	D’autres fournitures équivalentes peuvent être utilisées
Pipette à répétition	Eppendorf	4982000020	D’autres fournitures équivalentes peuvent être utilisées
Microcétrifuge	N’importe quelle marque		Toutes les marques peuvent être utilisées
Réfrigérateur, 2-8° C	N’importe quelle marque		Toutes les marques peuvent être utilisées
tourbillon	N’importe quelle marque		Toutes les marques peuvent être utilisées
Congélateur, -20 C	N’importe quelle marque		Toutes les marques peuvent être utilisées
Bain-marie, 37° C	N’importe quelle marque		N’importe quelle marque peut être utilisée, cependant, il est important soit de désactiver la circulation de l’eau, soit d’utiliser un bain-marie sans circulation, car le débit d’eau affectera la formation de caillots et conduira à des résultats faussement négatifs