Dosage du lysat d’amibocytes Gel-Caillot Limulus : une méthode de détection d’endotoxines bactériennes dans des formulations de nanoparticules

Résumé

Source : Neun, B. W. et al., Détection d’endotoxines dans les nano-formulations à l’aide de dosages de lysat d’amibocytes de Limulus (LAL). J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit un test de caillot de gel pour déterminer la présence d’endotoxines bactériennes dans des nano-formulations à l’aide de lysat d’amibocytes Limulus dérivé des cellules sanguines de limules. Le test permet de tester la contamination par les endotoxines des produits pharmaceutiques, y compris les formulations nano-dérivées.

Protocole

1. Préparation des échantillons de nanoparticules

1. Préparez l’échantillon d’étude dans de l’eau de qualité LAL.
2. Si le pH de l’échantillon se situe en dehors de la plage de 6 à 8, ajustez le pH en utilisant de l’hydroxyde de sodium apyrogène ou de l’acide chlorhydrique.
3. À l’aide d’eau de qualité LAL, préparez plusieurs dilutions de l’échantillon d’étude. Assurez-vous que la dilution la plus élevée ne dépasse pas la dilution maximale valide (MVD).

2. Préparation des réactifs communs entre les formats LAL

1. Diluer le stock concentré d’hydroxyde de sodium à l’aide d’eau réactive LAL apyrogène pour préparer une solution de travail à une concentration de 0,1 N.
2. Diluer un bouillon concentré d’acide chlorhydrique à l’aide d’eau réactive LAL apyrogène et préparer une solution de travail à une concentration finale de 0,1 N.
3. Préparation de l’étalon de contrôle des endotoxines (CSE)
   1. Reconstituer le CSE selon le certificat d’analyse fourni par le fabricant.
      note: Reportez-vous à la table des matériaux pour plus de détails concernant le numéro de catalogue et l’application d’une formulation CSE donnée dans différents formats de LAL.
4. Préparation du réactif LAL
   1. Reconstituer le réactif LAL selon le certificat d’analyse fourni par le fabricant.
      note: Reportez-vous à la table des matériaux pour plus de détails concernant le numéro de catalogue et l’application d’une formulation de réactif LAL donnée dans différents formats LAL.

3. LAL à caillot de gel

REMARQUE : Ce test identifie la présence d’endotoxines dans l’échantillon sur la base de l’observation visuelle et de la détection d’un caillot dans le tube réactionnel. Les étapes expérimentales sont décrites ci-dessous. Utilisez une feuille de banc pour consigner les résultats. Cette feuille de banc n’est pas obligatoire, et d’autres méthodes d’enregistrement des résultats d’analyse sont également acceptables. Un exemple d’une telle feuille de banc est fourni dans des documents supplémentaires pour la commodité du lecteur. Lambda (l) est la sensibilité du dosage du caillot de gel et est de 0,03 UE/mL.

1. Étiquetez autant de tubes de réaction que nécessaire pour tenir compte du nombre d’échantillons de test analysés. Reportez-vous à la feuille de banc pour plus de détails sur le nombre de répétitions utilisées à l’étape 1, à l’étape 2 et à l’étape 3 du test.
2. Aliquote 100 μL d’eau, de témoins ou d’échantillon d’essai par tube.
3. Préparer l’ESC de manière à ce que la concentration finale soit égale à 4λ.
4. Combiner 100 μL de l’étalon mentionné ci-dessus avec 100 μL d’eau ou d’échantillon d’essai pour obtenir la concentration finale de CSE de 2λ. Répétez l’opération trois fois de plus pour obtenir lambda et demi-lambda et un quart lambda.
5. Assurez-vous que la température dans le bain-marie est de 37 °C.
6. Ajoutez 100 μL de lysat par tube à essai, tournez brièvement et placez le support avec tous les tubes dans le bain-marie pendant 1 h.
7. Retournez le tube avec un mouvement fluide.
8. Enregistrez manuellement les résultats à l’aide d’un « + » (caillot ferme) ou d’un « - » (pas de caillot ou caillot lâche) sur la feuille de table.
9. Procéder à l’analyse selon l’USP BET 85 ; utiliser la feuille de banc comme matériau de support.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif LAL	Associés de Cape Cod	G5003	Ce réactif est spécifique au dosage du caillot de gel
Étalon de contrôle des endotoxines	Associés de Cape Cod	E0005	Ce réactif peut être utilisé avec des tests de turbidité et de caillot de gel
hydroxyde de sodium	sigma	S2770	Si nécessaire, il est utilisé pour ajuster le pH de l’échantillon entre 6 et 8
acide chlorhydrique	sigma	N° H9892	Si nécessaire, il est utilisé pour ajuster le pH de l’échantillon entre 6 et 8
Eau de qualité LAL	Associés de Cape Cod	Réf. WP0501	Ce réactif peut être utilisé avec n’importe quel format LAL
Tampon Glucashield	Associés de Cape Cod	Référence : GB051-25	Utilisé pour prévenir les réponses faussement positives des bêta-glucanes
Tubes de dilution en verre jetables sans endotoxines 12 x 75 mm	Associés de Cape Cod	TB240	Ces tubes peuvent être utilisés avec les trois tests
Tubes réactionnels en verre jetables sans endotoxines 10 x 75 mm	Associés de Cape Cod	TS050	Ces tubes sont destinés à être utilisés avec le dosage du caillot de gel
Embouts apyrogènes d’un volume de 0,25 et 1 mL	RAININ	PPT25, PPT10	Les pointes et les pipettes peuvent adsorber l’endotoxine et libérer des substances lixiviables qui interfèrent avec le dosage de la LAL. Ces pointes RAININ sont utilisées parce que leur performance optimale dans le test LAL a été vérifiée et confirmée
Tubes de microcentrifugation apyrogènes, 2,0 mL	Eppendorf	22600044	D’autres fournitures équivalentes peuvent être utilisées
Pyrogen-fee combitips, 5mL	Eppendorf	30089669	D’autres fournitures équivalentes peuvent être utilisées
Pipette à répétition	Eppendorf	4982000020	D’autres fournitures équivalentes peuvent être utilisées
Microcétrifuge	N’importe quelle marque		Toutes les marques peuvent être utilisées
Réfrigérateur, 2-8° C	N’importe quelle marque		Toutes les marques peuvent être utilisées
tourbillon	N’importe quelle marque		Toutes les marques peuvent être utilisées
Congélateur, -20 C	N’importe quelle marque		Toutes les marques peuvent être utilisées
Bain-marie, 37° C	N’importe quelle marque		N’importe quelle marque peut être utilisée, cependant, il est important soit de désactiver la circulation de l’eau, soit d’utiliser un bain-marie sans circulation, car le débit d’eau affectera la formation de caillots et conduira à des résultats faussement négatifs