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1. Activation de la plaque du kit de dosage
- Activer la plaque du kit de dosage du filtre à 96 puits (contenant du CPH-xylan bleu) (liste des matériaux) en ajoutant une solution d’activation de 200 μl (obtenue avec le kit) dans chaque puits, suivie d’une incubation de 10 minutes à température ambiante sans agitation.
- Appliquez le vide à l’aide d’un collecteur à vide (avec le bloc d’espacement à l’intérieur et n’importe quelle plaque standard transparente à 96 puits comme plaque de collecte) pour éliminer la solution d’activation existante. Il est également possible d’utiliser une centrifugeuse à 2 700 x g pendant 10 min pour cette étape à la place du collecteur à vide.
- Lavez les substrats CPH en ajoutant 100 μl d’eau stérile et appliquez un vide (ou une force centrifuge) pour retirer le stabilisant. Répétez cette étape deux fois de plus et les plaques sont maintenant prêtes à l’emploi.
2. Réaction enzymatique
REMARQUE : Incluez toujours le tampon seul comme témoin négatif et si possible les enzymes précédemment caractérisées comme témoins positifs. Utilisez un nombre statistiquement approprié de répétitions. Les substrats CPH sont stables entre pH 3,0 et 10,0 et le volume total de la solution enzymatique tampon dans chaque puits ne doit pas dépasser 180 μl. Un extrait de plante ou un bouillon de culture peut également être utilisé à la place d’une solution enzymatique purifiée.
- Ajouter 150 μl de tampon d’acétate de sodium, pH 4,5 et 5 μl de solution d’endocellulase (jusqu’à une concentration finale de 1 U/ml) dans chaque puits de la plaque du kit de dosage.
- Placez la plaque de produit (une plaque transparente compatible avec le lecteur de plaque de microtituro) sous la plaque du kit de dosage pour recueillir toute fuite potentielle de la plaque de réaction pendant l’agitation.
- Incuber la plaque du kit de dosage à 25 °C pendant 30 min dans un agitateur horizontal à 150 tr/min.
REMARQUE : Le mélange de la réaction dans la plaque du kit de test pendant l’incubation est crucial pour obtenir un résultat cohérent et reproductible. Les substrats CPH sont stables jusqu’à 90 °C. La durée d’incubation devrait être augmentée jusqu’à 24 heures lors de l’analyse de bouillons de culture contenant des concentrations enzymatiques inconnues avec des substrats CPH. Il convient de noter que les temps d’incubation appropriés dépendent de l’activité de l’enzyme ou des enzymes, mais en général, s’il n’y a pas d’activité détectable dans les 24 heures, il est probable que l’enzyme ne dégradera pas le substrat testé. Une enzyme active dégrade les polysaccharides chromogènes insolubles du substrat CPH en oligosaccharides chromogènes solubles, qui sont visibles sous forme de surnageant coloré.
- Placez la plaque de produit propre à l’intérieur du collecteur d’aspirateur avec le bloc d’espacement à l’intérieur.
- Placez la plaque du kit de test sur le dessus et appliquez un vide (pression négative maximale de -60 kPa). Il est également possible d’utiliser une centrifugeuse à 2 700 x g pendant 10 min
REMARQUE : Le filtrat contenant les oligosaccharides colorés en tant que produit de réaction est maintenant dans la plaque de produit pour une analyse plus approfondie.
3. Détection et quantification
- Vérifiez que le volume de liquide dans chaque puits de la plaque de produit est à peu près le même par inspection visuelle.
- Lire l’absorbance de la plaque collectrice à 595 nm pour le CPH-xylane bleu à l’aide d’un lecteur de plaques.
- Lors de l’analyse des données, soustrayez les valeurs de contrôle négatif du tampon uniquement des valeurs des puits où une enzyme a été ajoutée. Calculez la valeur moyenne et l’erreur type de moyenne (MEB) à partir des puits répliqués.