1. Dosage chromogène avec des substrats ICB dans un format à 96 puits
- Réaction enzymatique
- Ajouter le tampon d’acétate de sodium de 150 μl 100 mM, le pH 4,5 et la solution d’endo-xylanase de 5 μl 31 U/ml dans chaque puits de la plaque du kit de dosage contenant de la paille de blé ICB rouge (concentration enzymatique finale dans le puits : 1 U/ml).
note: Les plaques du kit de dosage (plaques filtrantes à 96 puits contenant des substrats ICB) sont fabriquées conformément à la documentation (voir la liste des matériaux). Les substrats ICB sont stables dans les tampons dont le pH est compris entre 3,0 et 10,0. Incluez toujours le tampon seul comme témoin négatif, les enzymes commerciales comme contrôle positif et utilisez un nombre statistiquement approprié de répliques.
- N’activez pas les substrats ICB comme la plaque de substrat CPH, mais retirez le stabilisant en lavant trois fois avec 100 μl d’eau suivi d’une filtration sous vide ou d’une centrifugation.
- Placez la plaque de produit sous la plaque de substrat pour recueillir toute fuite potentielle de la plaque de substrat pendant l’agitation.
- Incuber la réaction à 25 °C en agitant à 150 tr/min pendant 2 h
note: Une enzyme active dégrade les polysaccharides chromogènes insolubles dans le substrat de l’ICB en oligosaccharides solubles, qui sont visibles sous forme de surnageant coloré. Les substrats ICB sont stables jusqu’à 90 °C. Le temps d’incubation doit être augmenté jusqu’à 24 heures si des enzymes non purifiées telles que des bouillons de culture sont utilisées.
- Placez la plaque de produit à l’intérieur du collecteur à vide avec le bloc d’espacement à l’intérieur.
- Placez la plaque du kit de test sur le dessus et appliquez le vide (pression négative maximale de -60 kPa) ou utilisez une centrifugeuse pour filtrer le produit de la plaque du kit de test dans le puits de la plaque du produit.
note: Le filtrat contenant les oligosaccharides colorés comme produit de réaction se trouve maintenant dans la plaque de collecte pour une analyse plus approfondie.
2. Détection et quantification
- Vérifiez que le volume de liquide dans chaque puits de la plaque de collecte est à peu près le même par inspection visuelle.
- Lire l’absorbance de la plaque de collecte à 517 nm pour la paille rouge ICB-blé à l’aide d’un lecteur de plaque.
- Lors de l’analyse des données (soustraire le tampon), seules les valeurs de contrôle négatives des valeurs des puits où une enzyme a été ajoutée ont été ajoutées. Calculez la valeur moyenne et l’erreur type des moyennes (MEB) à partir de la réplication wells.
note: En cas de criblage d'enzymes inconnues, nous suggérons de faire une série de dilutions afin d'obtenir des données plus détaillées sur la plage dynamique de l'activité de l'enzyme.
