1. Dosage de la cytotoxicité : Configuration
- Préparez des solutions de composés d’intérêt aux concentrations souhaitées dans le milieu approprié (sans sérum ou 1, 2,5 ou 5 % FBS RPMI-1640).
- Pour mesurer la cytotoxicité d’un seul composé (p. ex., pour déterminer les doses efficaces), préparer des composés à une concentration finale de 2x.
- Pour mesurer la cytotoxicité des combinaisons de composés, préparez les composés à une concentration finale de 4x.
- Préparez des contrôles avec solvant seulement en mélangeant la même quantité de solvant avec le milieu approprié. Par exemple, si vous analysez des composés dissous dans du DMSO et du méthanol, effectuez un contrôle uniquement du solvant pour chaque solvant.
- Prélever les cellules de la boîte de culture ou du ballon dans un tube conique de 15 ml.
- Transvaser 10 μL de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation et colorer avec 10 μL de bleu de trypan à 0,4 %. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules viables et non viables pour chaque source cellulaire.
- Cellules de granulés à 200 g pendant 5 min. Aspirer ou décanter le surnageant.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu adapté au test (sans sérum ou 1, 2,5, 5 % FBS RPMI-1640) à une densité cellulaire de 3*105 cellules/mL.
REMARQUE 1 : La densité cellulaire de 3*105 cellules/mL fournit une densité d’ensemencement de 15 000 cellules/puits. La densité de semis est un paramètre important et, idéalement, devrait être prédéfinie avant l’expérience. La densité d’ensemencement doit tenir compte de 1) la taille des cellules – généralement les cellules plus grandes sont ensemencées à une densité plus faible ; 2) la durée du traitement – les cellules sont généralement ensemencées à une densité plus faible pour des expériences qui dureront plus longtemps, et 3) le taux de division cellulaire – les cellules ayant un taux de division plus élevé sont ensemencées à une densité plus faible. Exemples spécifiques de densités d’ensemencement optimisées : cellules K562, plus grandes, durée de 24 h – 10 000 cellules/puits ; Cellules MOLM-13, taille modérée, traitement 24 heures sur 24 – 15 000/puits ; cellules MOLM-13, traitement de 48 h – 8 000/puits ; petites cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) saines, traitement 24 heures sur 24 – 50 000/puits ; Cellules primaires de LMA, traitement 24 h – 15 000-20 000/well.
REMARQUE 2 : La présence de FBS dans les milieux peut affecter l’activité des composés. La réduction de la concentration de FBS peut rendre les résultats d’analyse plus simples à interpréter, mais elle réduit également la précision physiologique.
- Semez 50 μL de suspension cellulaire de l’étape 1.5 dans chaque puits d’une plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux.
- Ajouter les composés comme suit :
- Pour les dosages composés uniques, ajouter 50 μL de solution composée 2x dans chaque puits. Pour les puits témoins de solvant, ajouter 50 μL de milieu d’essai contenant le solvant à la concentration 2x.
- Pour les essais combinés, ajouter 25 μL de chacun des composés (4 solutions x) dans chaque puits. Pour les puits de contrôle composés simples, ajouter 25 μL de solution composée 4x et 25 μL de milieu d’essai. Pour les puits de contrôle de solvant, ajouter 50 μL de milieu d’essai ou de milieu d’essai contenant le solvant.
REMARQUE 1 : La concentration finale de DMSO ne doit pas dépasser 0,5 %.
REMARQUE 2 : Il est recommandé d’ajouter le milieu contenant les composés avec la pipette en contact avec la paroi de chaque puits en raison du faible volume.
- Tapotez doucement la plaque pour assurer le mélange du contenu des puits.
- Incuber les plaques à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 pendant une durée appropriée, par exemple 24 h.
2. Dosage de cytotoxicité : coloration au Hoechst 33342 et à l’iodure de propidium
- Préparez 10x solution de coloration. Cette solution doit être préparée fraîche avant chaque expérience, elle ne peut pas être stockée. Les concentrations finales de colorant doivent être déterminées avant l’expérience.
- Pour les lignées cellulaires de leucémie et les cellules de leucémie primaire, 1 mL de tampon de coloration 10x contient 10 μL de 20 mM Hoechst 33342 et 50 μL de 1 mg/mL d’iodure de propidium dans du PBS stérile (concentrations finales : Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL).
- Pour les PBMC sains, 1 mL de tampon de coloration 10x contient 10 μL de 20 mM de Hoechst 33342 et 10 μL de 1 mg/mL d’iodure de propidium dans du PBS stérile (concentrations finales : Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL).
note: La concentration finale d’iodure de propidium doit être déterminée avant les expériences. Les cellules doivent être testées à l’aide d’une gamme de concentrations d’IP (1, 2,5, 5 μg/mL), puis la viabilité calculée par Hoechst/IP doit être comparée à la viabilité mesurée par le bleu trypan. Les concentrations d’IP énumérées ci-dessus ont été choisies en fonction de la viabilité des cellules cibles dans les puits de contrôle des milieux (supérieure à ~90 % pour les lignées cellulaires de leucémie, supérieure à ~70 % pour les PBMC sains).
prudence: Le Hoechst 33342 et l’iodure de propidium sont des cancérogènes potentiels. Portez un équipement de protection individuelle approprié lorsque vous les manipulez.
- Après l’incubation, à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 10 μL de tampon de coloration 10x dans chaque puits.
note: Pour éviter la contamination croisée, assurez-vous que les pointes de la pipette ne touchent pas le support.
- Tapotez doucement la plaque pour mélanger et éliminer les bulles. Colorer à 37 °C pendant 15 min.
- Centrifugez la plaque à 200 g pendant 4 min pour ramener toutes les cellules au fond de la plaque. Essuyez soigneusement le bas de la plaque avec un kimwipe humide pour éliminer les fibres et/ou les débris qui interféreront avec l’imagerie.
REMARQUE 1 : La centrifugation de la plaque garantit les meilleures chances pour toutes les cellules d’être capturées dans l’image. Souvent, les cellules mortes se détachent et flottent, ce qui fournit des valeurs trompeuses de cytotoxicité. La centrifugation atténue cet effet.
REMARQUE 2 : La plaque doit être imagée le plus rapidement possible après la centrifugation, idéalement, dans les 15 minutes. La centrifugation peut réduire la sélectivité de la coloration PI et peut permettre aux cellules d’accumuler lentement de l’iodure de propidium. L’amélioration de la précision obtenue en visualisant les cellules mortes l’emporte sur la légère augmentation de la coloration PI
