Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Isolement des érythrocytes à partir du sang total
- Ajouter 500 μL de sang total dans du citrate acide dextrose (ACD) (stocké à 4 °C) dans un tube de microcentrifugation.
note: Le sang total a été acheté dans l’ACD. Selon la société, 1,5 ml de DCA est ajouté à 7 ml de sang total (volume total de 8,5 ml).
- Centrifuger le sang entier à 700 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) et prélever le plasma clair et la fine couche leucocytaire à l’aide d’une pipette pour laisser la couche érythrocytaire rouge.
- Préparez 1 L de solution Ringer contenant 125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgSO4, 32 mM d’HEPES, 5 mM de glucose et 1 mM de CaCl2. Ajustez le pH à 7,4 en ajoutant 2 gouttes d’eau de 1,0 M de NaOH. Pour préparer une solution Ringer sans glucose, suivez le même protocole, mais n’incluez pas de glucose dans la solution.
- Laver les érythrocytes 2 fois dans la solution de Ringer en suspendant la pastille cellulaire dans 1,5 mL de solution de Ringer, en centrifugeant à 700 x g pendant 5 min à RT et en éliminant le surnageant.
- Produire un hématocrite à 0,4 % en remettant en suspension 40 μL de la pastille érythrocytaire dans 9 960 μL de solution Ringer sans glucose pour atteindre un volume final de 10 mL.
note: L’hématocrite est un terme utilisé pour désigner la fraction volumique des érythrocytes en suspension. Un hématocrite à 0,4 % est une suspension contenant 0,4 % d’érythrocytes.
- Incuber la suspension cellulaire à 37 °C pendant 7 jours.
2. Traitement des érythrocytes par l’ionomycine et mesure de l’hémolyse
- Dissoudre 1 mg de sel d’ionomycine et de calcium dans 630 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour atteindre une concentration finale de 2 mM. Aliquote et conserver à -20 °C.
- Prélever 1 mL d’hématocrite à 0,4 % de l’étape 1.5 et ajouter 0,5 μL d’ionomycine à 2 mM pour atteindre une concentration finale de 1 μM. Incuber pendant 2 h à 37 °C.
- Utilisez 1 mL d’hématocrite sans traitement à l’ionomycine comme témoin négatif.
- Centrifugez les hématocrites traités et non traités à l’ionomycine à 700 x g pendant 5 min à RT et retirez leurs surnageants pour laisser les pastilles cellulaires au fond des tubes.
- Lavez les cellules 3 fois avec la solution Ringer en suspendant les pastilles cellulaires dans 1,5 mL de solution Ringer, en centrifugeant à 700 x g pendant 5 min à RT et en jetant les surnageants.
- Pour mesurer l’hémolyse, ajouter 1 mL d’hématocrite à 0,4 % non traité de l’étape 1.5 dans un tube de microcentrifugation et incuber pendant 2 h à 37 °C comme témoin négatif de l’hémolyse (0 %).
- Ajouter 1 mL d’hématocrite à 0,4 % non traité de l’étape 1.5 dans un tube de microcentrifugation et centrifuger à 700 x g pendant 5 min à RT. Retirer le surnageant et ajouter 1 mL d’eau distillée à la pastille cellulaire et incuber pendant 2 h à 37 °C comme témoin positif de l’hémolyse (100 %).
- Ajouter 1 mL d’hématocrite à 0,4 % traité à l’ionomycine de l’étape 2.2 dans un tube de microcentrifugation.
- Centrifuger les cellules non traitées, les cellules traitées et les cellules dans de l’eau distillée à 700 x g pendant 5 min à RT.
- Prélever 200 μL de surnageants et les ajouter dans une plaque à 96 puits.
- Mesurez l’absorbance à 541 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
- Calculer l’hémolyse à l’aide de l’équation 1 :
%Hémolyse = (AT - A0)/(A100 - A0)*100
où A0 est l’absorbance des érythrocytes dans la solution de Ringer, A100 est l’absorbance des érythrocytes dans l’eau et AT est l’absorbance des érythrocytes traités par l’ionomycine.
