Dosage de la liaison à l’annexine V : une technique basée sur la fluorescence pour identifier les érythrocytes apoptotiques via le marquage à la phosphatidylsérine

Abstract

Source : Bigdelou, P., et al. Induction de l’éryptose dans les globules rouges à l’aide d’un ionophore calcique. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration du test de liaison à l’Annexine V pour mesurer le degré d’éryptose, la mort cellulaire programmée par l’érythrocyte, à l’aide de la coloration fluorescente à l’Annexine V. Les érythrocytes apoptotiques présentent une translocation de la phosphatidylsérine de la feuille interne à la foliole externe de la membrane cellulaire, provoquant la liaison de l’annexine V marquée au fluorophore à la phosphatidylsérine transloquée, émettant ainsi un signal fluorescent.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Essai de liaison à l’annexine-V

1. Dissoudre 1 mg de sel d’ionomycine et de calcium dans 630 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour atteindre une concentration finale de 2 mM. Aliquote et conserver à -20 °C.
2. Prendre 1 mL d’hématocrite à 0,4 % et ajouter 0,5 μL de 2 mM d’ionomycine pour atteindre une concentration finale de 1 μM. Incuber pendant 2 h à 37 °C.
3. Centrifu....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V Alexa Fluor 488 - kit d’apoptose	Fisher Scientific	A10788	Conserver à 4 °C
Cytomètre en flux BD FACSAria II	BD Biosciences	643177
Sel de calcium ionomycine	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissoudre dans le DMSO pour atteindre 2 mM. Conserver à -20 °C
centrifugeuse	Millipore Sigma	Référence M7157	Modèle Eppendorf 5415C
Tube de cytométrie à flux rond jetable	VWR	VWRU47729-566
CaCl2	Fisher Scientific	Réf. C79-500
Le	VWR Sciences de la vie	SH30028.02
Tube de microcentrifugation	Fisher Scientific	Référence 02-681-5
Sang total dans l’ACD	Zen-Bio		Conserver à 4 °C et réchauffer à 37 °C avant utilisation