Dosage de la liaison à l’annexine V : une technique basée sur la fluorescence pour identifier les érythrocytes apoptotiques via le marquage à la phosphatidylsérine

Résumé

Source : Bigdelou, P., et al. Induction de l’éryptose dans les globules rouges à l’aide d’un ionophore calcique. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration du test de liaison à l’Annexine V pour mesurer le degré d’éryptose, la mort cellulaire programmée par l’érythrocyte, à l’aide de la coloration fluorescente à l’Annexine V. Les érythrocytes apoptotiques présentent une translocation de la phosphatidylsérine de la feuille interne à la foliole externe de la membrane cellulaire, provoquant la liaison de l’annexine V marquée au fluorophore à la phosphatidylsérine transloquée, émettant ainsi un signal fluorescent.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Essai de liaison à l’annexine-V

1. Dissoudre 1 mg de sel d’ionomycine et de calcium dans 630 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour atteindre une concentration finale de 2 mM. Aliquote et conserver à -20 °C.
2. Prendre 1 mL d’hématocrite à 0,4 % et ajouter 0,5 μL de 2 mM d’ionomycine pour atteindre une concentration finale de 1 μM. Incuber pendant 2 h à 37 °C.
3. Centrifugez les hématocrites traités et non traités à l’ionomycine à 700 x g pendant 5 min à RT, et retirez leurs surnageants pour laisser les pastilles cellulaires au fond des tubes.
4. Lavez les cellules 3 fois avec la solution Ringer en suspendant les pastilles cellulaires dans 1,5 mL de solution Ringer, en centrifugeant à 700 x g pendant 5 min à RT et en jetant les surnageants.
5. Remettre en suspension les pastilles de cellules érythrocytaires traitées et non traitées à l’ionomycine dans 1 mL de 1x tampon de liaison.
6. Diluez 2 mL du tampon de liaison 5x annexine V dans 8 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour obtenir 1x tampon de liaison.
7. Prélever 235 μL de suspensions cellulaires dans le tampon de liaison et ajouter 15 μL de conjugué Annexine V-Alexa Flour 488.
8. Incuber les cellules à température ambiante (RT) pendant 20 min dans un endroit sombre. Centrifuger à 700 x g pendant 5 min à RT et retirer le surnageant.
9. Lavez les cellules 2x avec 1x tampon de liaison, en suspendant la pastille de cellule dans 1,5 mL de tampon de liaison, en centrifugeant à 700 x g pendant 5 min à RT et en éliminant le surnageant.
10. Remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 250 μL de 1x tampon de liaison pour les mesures de cytométrie en flux.

2. Cytométrie en flux

1. Transférer 200 μL d’érythrocytes colorés à l’annexine V dans des tubes en polystyrène à fond rond de 1 mL compatibles avec la cytométrie en flux.
2. Connectez-vous au logiciel de cytométrie en flux et cliquez sur le bouton nouvelle expérience. Cliquez sur le bouton du nouveau tube. Sélectionnez la feuille globale et choisissez l’analyse d’application pour mesurer l’intensité de fluorescence avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et une longueur d’onde d’émission de 530 nm.
3. Définissez le nombre de cellules à 20 000 à collecter pour l’analyse de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
4. Sélectionnez le tube souhaité et cliquez sur le bouton de chargement. Cliquez sur le bouton d’enregistrement pour les mesures de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale. Répétez l’opération pour tous les échantillons.
5. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur le bouton de l’échantillon et cliquez sur appliquer l’analyse par lots pour générer le fichier de résultat.
6. Faites un clic droit sur le bouton de l’échantillon et cliquez sur générer des fichiers FSC.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Annexin V Alexa Fluor 488 - kit d’apoptose	Fisher Scientific	A10788	Conserver à 4 °C
Cytomètre en flux BD FACSAria II	BD Biosciences	643177
Sel de calcium ionomycine	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissoudre dans le DMSO pour atteindre 2 mM. Conserver à -20 °C
centrifugeuse	Millipore Sigma	Référence M7157	Modèle Eppendorf 5415C
Tube de cytométrie à flux rond jetable	VWR	VWRU47729-566
CaCl2	Fisher Scientific	Réf. C79-500
Le	VWR Sciences de la vie	SH30028.02
Tube de microcentrifugation	Fisher Scientific	Référence 02-681-5
Sang total dans l’ACD	Zen-Bio		Conserver à 4 °C et réchauffer à 37 °C avant utilisation