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REMARQUE : Comme point de référence pratique pour les lecteurs, la méthodologie suivante décrit les conditions de culture spécifiques et les matériaux requis pour la mesure de la biodisponibilité du Fe à partir de 20 échantillons expérimentaux, ainsi que les contrôles de qualité requis, dans une série d’essais biologiques. Il n’est pas recommandé d’augmenter le nombre d’échantillons au-delà de cette capacité en raison du temps nécessaire aux différentes étapes de culture cellulaire et de digestion in vitro dans le cadre de l’essai biologique.
1. Choisir la quantité d’échantillons
- Pour les aliments solides ou liquides, déterminer une quantité d’aliment qui peut être considérée comme représentative de l’échantillon à analyser.
- Pour tester la biodisponibilité du Fe à partir d’une variété de haricot, utilisez 100 à 150 g de graines de haricot et transformez cette quantité en un échantillon homogène.
- Pour les échantillons liquides tels que les jus enrichis, les produits laitiers et les boissons pour sportifs, assurez-vous que les aliments sont bien mélangés avant l’échantillonnage.
REMARQUE : La quantité de graines de haricot mentionnée ci-dessus est essentielle pour tenir compte des différences inhérentes entre les graines de cette culture de base.
2. Préparation des échantillons
- Rincez la terre et la poussière de tout échantillon d’aliment avec de l’eau distillée-déminéralisée avant le traitement.
- Traitez la quantité appropriée d’échantillon conformément aux objectifs expérimentaux, par exemple par la méthode de cuisson et le broyage.
REMARQUE : Pour la cuisson et le traitement, il est essentiel d’utiliser des ustensiles de cuisine et des équipements qui ne sont pas une source potentielle de contaminant Fe. L’équipement en acier inoxydable ne contamine pas ; cependant, des équipements tels que des broyeurs de pierre, des ustensiles de cuisine en fonte et tout équipement non en acier inoxydable contenant du Fe peuvent ajouter des quantités importantes de Fe contaminant. Un moulin à café standard en acier inoxydable est souvent adéquat pour le broyage.
- Lyophiliser et broyer en une poudre homogène.
REMARQUE : Une fois homogénéisé, la recherche a montré que trois réplications indépendantes de l’analyse sont adéquates pour chaque aliment mesuré.
- Si l’homogénéité de l’échantillon est difficile à obtenir, réviser la formulation ou le traitement du produit. Si cela n’est pas possible, ajoutez des réplications si la non-homogénéité n’est pas grave.
- Pour la plupart des aliments solides homogènes, utiliser 0,5 g d’échantillon lyophilisé par répétition. Si nécessaire, utilisez jusqu’à 1,0 g d’échantillon par répétition, mais vérifiez si plus de 0,5 g apporte un bénéfice en termes de degré de réponse.
REMARQUE : Des quantités supérieures à 0,5 g d’aliments solides peuvent obstruer la membrane de dialyse (voir ci-dessous).
- Utiliser 1 à 2 mL d’échantillons liquides.
note: La lyophilisation n’est souvent pas nécessaire pour les échantillons liquides.
3. Culture cellulaire Caco-2
- Cultures mères
- Acquérez des cellules Caco-2 auprès d’un fournisseur certifié.
- Cultivez les cellules à partir de flacons mères à 37 °C dans un incubateur avec une atmosphère d'air de 5 % de CO2 (humidité constante) en utilisant le milieu d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 25 mM d'HEPES (pH 7,2), 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal (FBS) et une solution d'antibiotique-antimycosique à 1 %.
- Une fois qu’il y a suffisamment de cellules disponibles, généralement après 7 à 10 jours de culture, ensemencez les cellules dans des flacons non enrobés de collagène à une densité de 30 000 cellules/cm2.
- Choisissez la taille du ballon en fonction du nombre de cellules disponibles et nécessaires à l’ensemencement des plaques multipuits.
REMARQUE : En général, les flacons T225 (225 cm2) fonctionnent mieux pour les expériences où 11 plaques multipuits (6 puits ; 9,66 cm2/puits) sont utilisées (10 plaques pour les comparaisons d’échantillons, 1 plaque pour les contrôles de qualité) par essai biologique.
- Cultivez les cellules dans des flacons pendant 7 jours, en changeant le milieu tous les deux jours, et utilisez-les le 7ème jour pour l’ensemencement des plaques multipuits.
REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser une plage de passage ne dépassant pas 10 à 15 passages à partir du moment où les cellules sont démarrées à partir de la culture mère et ensuite utilisées dans une série d’expériences. Les passages de culture cellulaire doivent être limités, car un large éventail de passages peut entraîner des changements adaptatifs dans la lignée cellulaire et, par conséquent, une variabilité de la réponse du modèle.
- Culture cellulaire sur plaques multipuits
- Ensemencez les cellules Caco-2 à une densité de 50 000 cellules/cm2 dans des plaques enrobées de collagène à 6 puits.
REMARQUE : Cette étape fonctionne généralement mieux si elle est effectuée un mercredi. Les étapes suivantes vous permettront de comprendre pourquoi ce jour de la semaine est optimal.
- Faites pousser les cellules pendant 12 jours à 37 °C dans un incubateur avec une atmosphère de 5 % de CO2 (humidité constante) à l’aide de DMEM complété par 25 mM d’HEPES (pH 7,2), 10 % (v/v) de FBS et 1 % de solution antibiotique-antimycosique.
REMARQUE : La culture des monocouches cellulaires pendant plus de 12 jours peut entraîner une prolifération cellulaire. Des recherches antérieures ont clairement montré que, dans ces conditions, 12 jours après l’ensemencement, la monocouche cellulaire est mature, bien attachée à la plaque et optimale dans la consistance de la réponse. La croissance des cellules plus longue, par exemple jusqu’à 19 à 21 jours, entraîne une prolifération cellulaire et le milieu s’épuise rapidement en nutriments, ce qui entraîne des monocouches malsaines.
- Pendant la période de 12 jours, changez de support au moins tous les 2 jours selon un horaire quotidien régulier.
- Le 12e jour après l'ensemencement, remplacer le milieu de culture par 2 mL de milieu essentiel minimum (MEM [pH 7]) complété par 10 mM de PIPES (pipérazine-N,N'-bis-[acide 2-éthanesulfonique]), une solution antibiotique-antimycosique à 1 %, de l'hydrocortisone (4 mg/L), de l'insuline (5 mg/L), du sélénium (5 μg/L), de la triiodothyronine (34 μg/L) et du facteur de croissance épidermique (20 μg/L).
REMARQUE : Si l’ensemencement a commencé un mercredi, le 12e jour serait un lundi.
- Le lendemain (c’est-à-dire le jour 13), retirez le MEM et remplacez-le par 1 ml de MEM (pH 7).
REMARQUE : Cette étape aurait lieu un mardi. C’est le jour où l’essai biologique commence ; Ainsi, le calendrier de 13 jours présente l’avantage d’un calendrier hebdomadaire cohérent, ce qui permet d’effectuer l’essai biologique de manière cohérente le même jour de la semaine.
4. Digestion in vitro
- Préparation des bagues d’insertion
- Créez un anneau d’insertion stérilisé à l’aide d’un joint torique en silicone équipé d’une membrane de dialyse lavée à l’acide (Figure 1A).
REMARQUE : Préparez les inserts 1 jour à l’avance (c’est-à-dire le lundi, jour 12) du jour de l’essai biologique et conservez-les dans de l’eau à 18 MΩ à 4 °C jusqu’au moment de l’utiliser.
- Le jour de l’essai biologique (mardi, jour 13), retirez les inserts du réfrigérateur, égouttez-les et remplacez l’eau par 0,5 M HCl. Laissez-le à température ambiante dans une hotte à flux laminaire pendant au moins 1 h avant de l’utiliser.
REMARQUE : Cette étape doit être effectuée avant de retirer le MEM des plaques de culture. Le lavage à l’acide de la membrane sert à éliminer les éventuels Fe contaminants et stérilise l’anneau d’insertion et la membrane.
- Videz le HCl 0,5 M des inserts et rincez-les à l’eau stérile 18 MΩ. Conserver dans de l’eau stérile de 18 MΩ à température ambiante dans une hotte à flux laminaire jusqu’au moment de l’utiliser.
- Insérez un anneau dans chaque puits des plaques à 6 puits avec des cellules Caco-2, créant ainsi un système à deux chambres. Remettre les plaques avec les inserts dans l’incubateur.
REMARQUE : Cette étape doit être effectuée juste après l’ajout de 1,0 ml de MEM frais dans chaque puits (voir l’étape 3.2.5.).
- Préparation de la solution de pepsine
- Le jour de l’expérience, préparez la solution de pepsine en dissolvant 0,145 g de pepsine dans 50 ml de HCl 0,1 M. Agitez doucement la solution sur une plate-forme agitée pendant 30 min à température ambiante.
- Préparation de la solution de pancréatine et de bile
- Le même jour que l’expérience, préparez 0,1 M de NaHCO3 en dissolvant 2,1 g de NaHCO3 dans 250 ml d’eau à 18 MΩ.
- Mélanger 0,35 g de pancréatine et 2,1 g d’extrait de bile dans 175 mL de 0,1 M de NaHCO3.
- Une fois la pancréatine et l’extrait de bile solubilisés, ajoutez 87,5 g d’une résine échangeuse de cations faible (voir le tableau des matériaux) et mélangez en agitant pendant 30 min à température ambiante.
- Versez la boue dans une grande colonne et récupérez l’éluat.
- Éluer la colonne avec 70 ml supplémentaires de 0,1 M de NaHCO3, en recueillant ce volume dans la solution biliaire de pancréatine.
REMARQUE : Le but de la résine est d’éliminer le contaminant Fe que l’on trouve couramment dans les extraits de pancréatine et de bile.
- Amorcer la digestion in vitro.
- Peser l’échantillon dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL (polypropylène), puis ajouter 10 mL de solution saline physiologique à pH 2, contenant 140 mM de NaCl et 5 mM de KCl.
- Amorcer le processus de digestion gastrique en ajoutant 0,5 mL de la solution de pepsine porcine préparée à l’échantillon et incuber sur un agitateur à bascule à basse température pendant 1 h à 37 °C.
- Après cette période, amorcez le processus de digestion intestinale de chaque échantillon en ajustant le pH à 5,5-6,0 avec 1,0 M de NaHCO3.
- Ajouter 2,5 mL de la solution de pancréatine et de bile dans chaque tube d’échantillon et ajuster le pH à 6,9-7,0 avec 1,0 M de NaHCO3.
- Une fois le pH ajusté, égaliser le volume dans chaque tube à l’aide d’une solution de 140 mM de NaCl et 5 mM de KCl (pH 6,7), en mesurant le poids du tube avec une valeur cible de 15 g.
REMARQUE : Pour certains aliments, il peut être nécessaire de porter le volume total à 16 g ou 17 g, selon la capacité tampon des aliments.
- Transférez 1,5 mL de chaque digestat intestinal dans la chambre supérieure (c.-à-d. contenant l’anneau d’insertion avec la membrane de dialyse) d’un puits correspondant de la plaque de culture à 6 puits contenant les cellules Caco-2 (figure 1B).
- Replacez le couvercle de la plaque et incubez à 37 °C (5 % deCO2 atmosphère atmosphérique) sur un agitateur à bascule à 6 oscillations/min pendant 2 h.
- Retirez l’anneau d’insertion avec le digestat et ajoutez 1 ml supplémentaire de MEM (pH 7) dans chaque puits.
- Remettez la plaque de culture cellulaire dans l’incubateur (37 °C ; 5 % deCO2 dans l’atmosphère de l’air) pendant 22 heures supplémentaires.
- Après 22 h, retirer le milieu de culture cellulaire et ajouter 2,0 mL d’eau à 18 MΩ à la monocouche cellulaire.
REMARQUE : L’eau lysera osmotiquement les cellules.
- Récoltez l’intégralité du lysat cellulaire dans des microtubes à centrifuger en polypropylène standard ou similaires pour des analyses ultérieures des protéines cellulaires et de la ferritine cellulaire.
