$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité de classe II avec le ventilateur allumé et les lumières éteintes.
1. Préparation des matériaux
REMARQUE : Tous les matériaux sont répertoriés dans le tableau des matériaux.
- Préparez le milieu 1, le milieu de centrifugation 2 et les solutions d’entreposage et de travail de 2-désoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose (2-NBDG ou FD-glucose) conformément au tableau 1 dans une enceinte de biosécurité de classe II. Protégez le FD-glucose de la lumière tout au long de l’expérience en éteignant toutes les lumières sous le capot.
- Utilisez des réactifs de culture cellulaire prêts à l'emploi : trypsine-EDTA, solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et milieu modifié Dulbecco's Eagle sans glucose et sans rouge de phénol (ci-après, DMEM sans glucose).
- Utiliser 20 mL de tampon de lyse pour test de radio-immunoprécipitation (RIPA).
REMARQUE : Dans les sections suivantes, la déplétion extracellulaire et l’absorption intracellulaire de différentes doses de FD-glucose sont comparées dans des fibroblastes 3T3-L1 avec et sans stimulation insulinique (Figure 1).
2. Culture cellulaire 3T3-L1 et entretien
- Cultivez des fibroblastes de souris 3T3-L1 en plaquant 1 x 106 cellules diluées dans 20 mL de Medium 1 dans deux plaques de 96 puits. Plaque de 100 μL de suspension cellulaire par puits, en veillant à maintenir l’homogénéité de cette suspension par mélange. Cultiver des cellules pendant 48 h dans un incubateur à 37 °C (5 % de CO2 et 95 % d’humidité) sans changer de milieu jusqu’à environ 70 % à 80 % de confluence.
- Maintenir les cellules confluentes et à jeun en les cultivant dans le même milieu pendant 48 h. Variez le temps d’incubation de 24 à 72 h en fonction de l’état catabolique à jeun souhaité.
3. Famine des cellules 3T3-L1
- Décantez le milieu des cellules dans les plaques à 96 puits. Absorbez le liquide restant à l’aide d’essuie-tout stériles.
- Rincez la plaque à 96 puits avec 100 μL de PBS par puits et absorbez le liquide restant avec des serviettes en papier stériles.
- Ajouter 100 μL de DMEM sans glucose par puits et incuber pendant 40 min. Ajustez le temps d’incubation en fonction du type de cellule, des stimuli et du niveau de jeûne souhaité.
REMARQUE : Le temps d’incubation peut nécessiter une optimisation selon la saison.
4. Préparation de solutions FD-glucose avec différentes concentrations
NOTE : L’expérience de la figure 1 examine les milieux extracellulaires et intercellulaires avec et sans stimulation par l’insuline.
- Utilisez huit répétitions (une rangée dans une plaque de 96 puits) pour chaque condition de stimulation. Par conséquent, préparez 1 mL pour chaque condition de stimulation (spécifiée dans le tableau 2 et ci-dessous).
- Utilisez huit conditions de stimulation sans insuline : FD-glucose de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL et 0 μg/mL (contrôle sans FD-glucose) dans une plaque de 96 puits.
- Utiliser huit conditions de stimulation avec de l’insuline (10 μg/mL, concentration finale) : FD-glucose de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL et 0 μg/mL (témoin sans FD-glucose) dans une autre plaque à 96 puits.
- Pour préparer les conditions de stimulation, diluer 1 μL de solution de travail FD-glucose à 5 mg/mL (tableau 1) dans 999 μL de DMEM sans glucose pour obtenir 1 mL de solution mère (dilution 1:1000 ou 5 μg/mL).
- À l’aide de cette solution mère, préparer des dilutions de glucose FD à l’échelle 1:2000, 1:5000, 1:10 000, 1:25 000, 1:50 000 et 1:100 000 pour obtenir des dilutions de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL et 0,05 μg/mL (tableau 2) dans des tubes de 2 mL immédiatement avant les expériences dans une enceinte de biosécurité sans lumière.
- Répétez l’étape 4.4 et ajoutez 1 μL d’insuline (10 mg/mL, concentration finale) à chacune des conditions spécifiées ci-dessus.
REMARQUE : La concentration finale d’insuline dans ces échantillons est de 10 μg/mL = 1,7 nmol/mL. Pour obtenir une homogénéisation, ajoutez de l’insuline dans les tubes avant d’ajouter d’autres solutions.
5. Traitement des cellules 3T3-L1 affamées
- Après 40 minutes d’incubation, décantez le DMEM sans glucose de chaque puits dans des plaques de 96 puits et absorbez le liquide restant avec des serviettes en papier stériles.
- Ajouter 100 μL (par puits) provenant des diverses conditions de traitement décrites ci-dessus aux puits le long d’une colonne, et 100 μL (par puits) provenant des mêmes conditions de traitement aux puits le long de la rangée (huit répétitions) dans les deux plaques de 96 puits. Étiquetez les plaques qui ont utilisé les conditions avec et sans insuline. Ajoutez du DMEM sans glucose seul dans les puits témoins (n = 8).
- Incuber la plaque pendant 40 min dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité) dans l’obscurité.
6. Mesures extracellulaires et intercellulaires pour les cellules 3T3-L1 stimulées
- Après que les cellules ont été stimulées pendant 40 minutes, transférez les milieux de stimulation des deux plaques dans de nouvelles plaques à 96 puits en conservant la même disposition expérimentale.
- Décantez toute solution restante des plaques originales stimulées à 96 puits avec des cellules sur des serviettes en papier stériles.
- En option, lavez les cellules avec du PBS. Retirez le PBS et décantez toute solution restante sur des serviettes en papier stériles.
- Ajouter 100 μL de tampon de lyse RIPA dans chaque puits. En option, ajoutez un inhibiteur de protéase au tampon RIPA pour protéger les protéines. Placer les assiettes contenant du RIPA dans un agitateur pendant 30 min.
- À l’aide d’un lecteur de microplaques (Table des matériaux), mesurez la fluorescence aux longueurs d’onde d’excitation (Ex) et d’émission (Em) de 485 et 535 nm, respectivement, d’abord dans le milieu contenant du FD-glucose extracellulaire, puis dans la plaque avec des cellules lysées par RIPA, à la fin de 30 min d’incubation (voir étape 6.4).
Tableau 1 : Préparation des milieux de culture et des solutions FD-glucose.
| Solution/Milieu | Composants |
| Éthanol : DMSO (1:1/v/v) | Éthanol (200 μL) et DMSO (200 μL) dans un tube de 1 à 1,5 mL ; utilisez de l’éthanol et du DMSO de qualité culture cellulaire |
| Moyenne 1 | DMEM (89 ml), pénicilline/streptomycine (1 %) (1 ml) et sérum de veau (10 %) (10 ml) dans un tube stérile de 50 ml |
| Milieu de centrifugation 2 | DMEM (89 mL), pénicilline/streptomycine (1 %) (1 mL) et sérum bovin (10 %) (10 mL) dans un tube stérile de 50 mL |
| Solution de glucose FD de stockage 5 mg/mL (14,5 mM) | Glucose FD (1 mg) et éthanol :DMSO (1:1/v/v) (200 μL) dans un tube de 0,5 mL ; stocker à -80 °C, de préférence sous atmosphère d’argon ou d’azote |
| Solution de glucose FD de travail 5 μg/mL (14,5 mM) | Solution de glucose FD 5 mg/mL (1 μL), DMEM sans glucose (999 μL) ; préparer immédiatement avant l’expérience. |
Tableau 2 : Préparation de solutions FD-glucose avec différentes concentrations pour les expériences présentées à la figure 1.
| dilution | contrôle | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2,5 x 104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| Concentration (μg/mL) | 0 | 2.5 | 1 | 0,5 | 0,2 | 0,1 | 0,05 |
| DMEM sans glucose (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD Glucose 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
