Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité de classe II avec le ventilateur allumé et les lumières éteintes.
1. Préparation des matériaux
REMARQUE : Tous les matériaux sont répertoriés dans le tableau des matériaux.
- Préparez le milieu 1, le milieu de centrifugation 2 et les solutions d’entreposage et de travail de 2-désoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose (2-NBDG ou FD-glucose) conformément au tableau 1 dans une enceinte de biosécurité de classe II. Protégez le FD-glucose de la lumière tout au long de l’expérience en éteignant toutes les lumières sous le capot.
- Utilisez des réactifs de culture cellulaire prêts à l'emploi : trypsine-EDTA, solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et milieu modifié Dulbecco's Eagle sans glucose et sans rouge de phénol (ci-après, DMEM sans glucose).
2. Mesure ex vivo de la déplétion extracellulaire en FD-glucose dans les organes
- Prétraitez les souris avec des composés stimulant le métabolisme du glucose avant la dissection de l’organe, comme suit.
- Utilisez des souris mâles Lepob âgées de neuf semaines (n = 11). Nourrissez toutes les souris avec un régime alimentaire régulier avant l’expérience.
- Répartissez les souris au hasard en trois groupes pour les injections intrapéritonéales (i.p.).
- Injecter aux souris du groupe témoin Lepob 0,1 mL de PBS stérile (n = 4).
- Injecter à des souris du groupe insuline Lepob 0,1 mL de PBS stérile, contenant 12 UI d’insuline humaine par gramme de poids corporel (n = 3).
- Injecter aux souris du groupe AAC2 Lepob 0,1 mL de PBS stérile, contenant 0,1 nmol d’AAC2 par gramme de poids corporel (n = 4).
- Après 15 min, soumettre les souris à l’inhalation d’isoflurane à 5 % et exsangucher le sang par ponction cardiaque des animaux anesthésiés.
- Disséquer le tissu adipeux blanc viscéral épidydimal (200 mg), le foie (200 mg) et le cerveau entier de chaque animal. Utilisez une cagoule de biosécurité de classe II pour la manipulation des tissus.
- Préparez une solution de dosage FD-glucose (0,29 mM) dans du DMEM sans glucose dans une enceinte de biosécurité de classe II sans lumière.
- Mesurez la fluorescence de la solution de travail FD-glucose (0,29 mM) à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 485 et 535 nm, respectivement, à l’aide d’un lecteur de microplaques.
- Incuber les tissus/organes prélevés dans une plaque à 6 puits contenant du PBS pendant 1 min. Manipulez chaque tissu ou organe dans un puits séparé.
- Après 1 min, placez chaque mouchoir sur une serviette en papier stérile pour absorber le PBS. Transférez les tissus/organes dans une plaque séparée à 6 puits contenant 4 000 μL de DMEM sans glucose et incubez pendant 2 min.
- Après 2 min, retirez et transférez les tissus dans les puits d’une plaque à 6 puits contenant 0,29 mM de solution de travail FD-glucose (1 mL/puits). Incuber les plaques à 6 puits contenant les tissus dans une solution de travail FD-glucose à 37 °C (5 % de CO2 et 95 % d’humidité).
- Prélever 100 μL de solution de travail FD-glucose dans chaque puits après 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 min d’incubation, afin d’analyser la cinétique de l’épuisement extracellulaire du glucose FD. Agiter avant et après le prélèvement.
- Transférez 100 μL de solution de travail FD-glucose dans des plaques à 96 puits pour mesurer la fluorescence à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 485 et 535 nm, respectivement, à l’aide d’un lecteur de microplaques.
- Normaliser la fluorescence à la valeur 0 min (100 %) pour chaque organe de chaque animal (Figure 1).
Tableau 1 : Préparation des milieux de culture et des solutions FD-glucose.
| Solution/Milieu | Composants |
| Éthanol : DMSO (1:1/v/v) | Éthanol (200 μL) et DMSO (200 μL) dans un tube de 1 à 1,5 mL ; utilisez de l’éthanol et du DMSO de qualité culture cellulaire |
| Moyenne 1 | DMEM (89 ml), pénicilline/streptomycine (1 %) (1 ml) et sérum de veau (10 %) (10 ml) dans un tube stérile de 50 ml |
| Milieu de centrifugation 2 | DMEM (89 mL), pénicilline/streptomycine (1 %) (1 mL) et sérum bovin (10 %) (10 mL) dans un tube stérile de 50 mL |
| Solution de glucose FD de stockage 5 mg/mL (14,5 mM) | Glucose FD (1 mg) et éthanol :DMSO (1:1/v/v) (200 μL) dans un tube de 0,5 mL ; stocker à -80 °C, de préférence sous atmosphère d’argon ou d’azote |
| Solution de glucose FD de travail 5 μg/mL (14,5 mM) | Solution de glucose FD 5 mg/mL (1 μL), DMEM sans glucose (999 μL) ; préparer immédiatement avant l’expérience. |
