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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local
1. Mesure de la contraction (exemples SMC)
- Préparez un réseau ECIS 96w10e (voir la figure 1A pour une image représentative du réseau avec des électrodes agrandies et des cellules ensemencées sur les électrodes).
REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes sous une hotte à flux laminaire de culture de tissus stériles.
- Enduire un réseau stérile de 96w10e avec 200 μL de 10 mM de L-cystéine par puits pendant 30 min à température ambiante.
- Lavez la plaque deux fois à l’eau stérile. Laissez sécher la plaque pendant la nuit dans le capot de culture tissulaire avec le couvercle légèrement ouvert.
REMARQUE : L’enrobage de la plaque avec de la L-cystéine n’est nécessaire que lors de la première utilisation de la plaque.
- Le lendemain, stérilisez la plaque et le couvercle aux UV pendant 30 min. Tournez le couvercle vers le haut pour que l’intérieur soit stérilisé. Une fois la plaque stérilisée, n’ouvrez pas la plaque à l’extérieur de la hotte d’écoulement.
- Cellules d’ensemencement sur le réseau ECIS
- Préchauffer une solution de gélatine stérile à 1 % dans le bain-marie pendant 30 min
REMARQUE : La solution est conservée au réfrigérateur et peut se solidifier, ce qui rend difficile la pipette.
- Par la suite, enduire les puits de 100 μL de la solution de gélatine à 1 % par puits et incuber la plaque à 37 °C pendant au moins 1 h.
- Aspirez la gélatine des puits.
- Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et ensemencez les CMS en trois exemplaires à une densité d’ensemencement de 30 000 cellules/puits dans 200 μL de milieu de CMS.
- Placez la plaque avec les SMC dans le support ECIS à 96 puits dans l’incubateur de culture cellulaire. Double-cliquez sur le logiciel ECIS Applied Biophysics pour ouvrir le programme et appuyez sur le bouton Setup.
- Vérifiez si toutes les électrodes sont en contact avec le support (vert ; rouge s’il n’y a pas de connexion) dans le panneau inférieur gauche étiqueté Configuration du puits. Si les électrodes ne sont pas correctement connectées, ajustez la plaque dans le support avant de commencer la mesure.
- Sélectionnez le type de plaque (réseau de 96 puits) dans le même panneau en cliquant sur Type de réseau.
- Dans le panneau supérieur droit Configuration de la collecte de données, cliquez sur fréquence unique et modifiez la valeur d’impédance à 4000 Hz et l’intervalle à 8 s.
- Cliquez sur le bouton Démarrer pour démarrer les mesures. Attendez qu’un nouveau panneau s’ouvre, dans lequel le fichier ECIS peut être enregistré.
- Laisser les cellules se fixer et établir une monocouche pour 48 h.
REMARQUE : La fixation et l’étalement des cellules sur les électrodes génèrent une valeur de résistance de base (Figure 1B).
- Stimulation des cellules pour induire la contraction
- Induire la contraction du CMS en stimulant les cellules avec 10 μg/mL de l’ionophore calcique, ionomycine.
REMARQUE : L’ionomycine induira l’afflux de Ca2+ extracellulaire, activant la cascade contractile ; voir la figure 2A pour des images représentatives des cellules contractées non stimulées et stimulées.
- Diluer 1 mg de poudre d’ionomycine dans 100 μL de diméthylsulfoxyde pour obtenir une solution mère de 10 mg/mL et stocker 10 μL d’aliquotes à -20 °C. Avant utilisation, diluer la solution d’ionomycine 1:10 dans le milieu SMC pour préparer la solution de travail à ajouter aux cellules.
- Effectuez la stimulation cellulaire pendant que le réseau est encore dans le support de réseau à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire et que les électrodes sont fixées au système.
- Pour stimuler les cellules, retirez le couvercle et placez-le sur une surface stérile à l’intérieur de l’incubateur. Préparez deux pipettes, réglées à 2 μL et 150 μL.
- Avant de commencer la stimulation, appuyez sur Marquer dans le logiciel et placez un commentaire.
REMARQUE : Cela facilitera la recherche du moment exact de la stimulation lors de l’analyse des données.
- Pipeter 2 μL de la solution de travail d’ionomycine dans chaque puits le plus rapidement possible. Une fois toutes les cellules stimulées, mélangez le milieu dans les puits à l’aide de la deuxième pipette.
REMARQUE : En raison des effets rapides, il n’est pas nécessaire de changer les pointes entre différentes lignées cellulaires et conditions. Agir rapidement tout en stimulant et en mélangeant car l’ionomycine a un effet aigu. Lorsque vous stimulez une plaque pleine, stimulez un maximum de 3 colonnes à la fois. Après chaque stimulation, attendez au moins 30 minutes jusqu’à la prochaine stimulation pour permettre aux cellules de récupérer de la variation de température et de CO2 causée par l’ouverture de la porte de l’incubateur.
- Directement après la fin de la stimulation, appuyez à nouveau sur Marquer pour ajouter un commentaire indiquant que la stimulation est terminée.
- Terminer l’expérience de stimulation
- Enregistrez les valeurs d’impédance pendant environ 5 minutes après la stimulation de l’ionomycine. Terminez l’enregistrement en appuyant sur Terminer.
