Le test du filament d’actine glissant : un test de motilité in vitro pour étudier la translocation des filaments d’actine sur des myosines immobilisées

Résumé

Source : Tripathi, A., et al. Adaptations spécifiques à la myosine des tests de motilité basés sur la microscopie à fluorescence in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

Dans cette vidéo, nous effectuons un test de motilité in vitro pour analyser les interactions actine-myosine. Le mouvement de glissement des filaments d’actine sur des molécules de myosine immobilisées est visualisé à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Protocole

1. Dosage des filaments d’actine planants

1. Préparation de la lamelle
   1. Préparez une solution de nitrocellulose à 1 % dans de l’acétate d’amyle.
   2. Procurez-vous une boîte de culture tissulaire (150 x 25 mm) et ajoutez un papier filtre circulaire (125 mm de diamètre) au fond de la boîte.
   3. Chargez huit lamelles carrées n° 1,5 d’épaisseur et de 22 mm sur une grille et lavez-les avec environ 2 à 5 ml d’éthanol à 200 degrés suivis de 2 à 5 ml d’eau distillée (dH₂O). Répétez cette étape de lavage en terminant par de l’eau. Ensuite, séchez complètement les lamelles à l’aide d’une conduite d’air filtré ou d’une ligne N₂.
   4. Prenez une lamelle et pipetez lentement 10 μL de la solution de nitrocellulose à 1 % le long d’un bord de la lamelle. Ensuite, d’un mouvement fluide, étalez-le sur le reste de la lamelle à l’aide du côté d’une pointe de pipette à parois lisses de 200 μL. Placez cette lamelle sur la boîte de culture tissulaire avec la nitrocellulose vers le haut. Répétez l’opération pour les lamelles restantes et laissez-les sécher pendant la préparation des réactifs restants, et utilisez les lamelles dans les 24 heures suivant l’enrobage.
2. Préparation de la chambre
   1. Essuyez une lame de microscope avec un papier à lentille optique pour nettoyer les gros débris. Coupez deux morceaux de ruban adhésif double face d’environ 2 cm de longueur.
   2. Placez un morceau au milieu du bord long de la lame de microscope. Assurez-vous que le bord du ruban est aligné avec le bord de la glissière. Placez le deuxième morceau de ruban à environ 2 mm sous le premier morceau de ruban adhésif de sorte que les deux soient parallèles et alignés. Cela crée une chambre d’écoulement pouvant contenir environ 10 μL de solution (voir Figure 1).
   3. Prenez l’une des lamelles recouvertes de nitrocellulose de la partie 1. Collez soigneusement la lamelle sur le ruban de sorte que le côté recouvert de nitrocellulose entre en contact direct avec le ruban (voir Figure 1). À l’aide d’une pointe de pipette, appuyez doucement sur l’interface de la bande coulissante pour vous assurer que la lamelle a correctement adhéré à la lame. Coupez l’excédent de ruban adhésif qui pendait sur le bord de la diapositive avec une lame de rasoir.
3. Préparation à l’action
   1. Produire 20 μM d’actine F en polymérisant l’actine globulaire (G-actine) dans un tampon de polymérisation (50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0) à 4 °C pendant la nuit.
   2. Diluer l’actine fluorée à 5 μM dans un tampon de motilité (20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)). Marquer avec au moins 1,2x l’excès molaire de rhodamine-phalloïdine. Laisser (recouvert de papier d’aluminium) pendant au moins 2 h sur de la glace. Cela peut être utilisé jusqu’à 1 à 2 mois et stocké sur de la glace.
4. Réalisation du dosage des filaments d’actine planants de la myosine 5a
   REMARQUE : Dans cette section, les détails du test de glissement de la myosine 5a (HMM) sont fournis.
   1. Préparez les solutions de myosine 5a décrites dans le tableau 1 et conservez-les sur de la glace.
   2. Verser 10 μL de myosine 5a (50-100 nM) dans la chambre d’écoulement et attendre 1 min.
   3. Débit en 10 μL de la BSA 1 mg/mL en 50 mM MB avec 1 mM DTT (tampon « low salt »). Répétez ce lavage deux fois de plus et attendez 1 minute après le troisième lavage. Utilisez le coin d’un papier de soie ou d’un papier filtre pour évacuer la solution à travers le canal en plaçant doucement le coin du papier à la sortie de la chambre d’écoulement.
   4. Lavage avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
   5. Écoulez dans 10 μL de la solution d’actine noire (5 μM F-actine, 1 μM de calmoduline et 1 mM d’ATP dans 50 mM MB avec 1 mM de DTT) pour éliminer les « têtes mortes ».
      1. Pipeter la solution à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 27 G pour cisailler les filaments d’actine avant d’introduire la solution dans la chambre. Répétez cette étape deux fois de plus et attendez 1 minute après la troisième fois. Environ 20 événements de pipetage suffisent.
      2. Pour effectuer la rotation de la « tête morte », ajoutez une quantité stœchiométrique d’actine F à la myosine en présence de 1 mM d’ATP et de 1 mM de MgCl₂ à une concentration en sel de 500 mM. Puis ultracentrifugeuse à 480 000 x g pendant 15 min à 4 °C. La myosine morte sera dans la pastille.
   6. Débit en 50 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT et 1 mM ATP pour épuiser la chambre en filaments d’actine libres.
   7. Lavage avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT. Répétez ce lavage deux fois de plus pour épuiser la chambre de tout ATP.
   8. Verser dans 10 μL une solution de rhodamine actine (Rh-Actin) à 20 nM contenant 1 mM de DTT dans 50 mM MB et attendre 1 min pour permettre la liaison rigoureuse des filaments d’actine à la myosine 5a fixée à la surface de la lamelle.
   9. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM de DTT pour éliminer les filaments de Rh-Actine non liés à la surface. Répétez ce lavage deux fois de plus.
   10. Débit dans 30 μL de tampon final.
   11. Enregistrez des images sur un microscope à fluorescence en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 561 nm pour visualiser l’actine Rh. Un temps d’exposition approprié est de 200 ms à une puissance laser de 1,4 mW pour une durée d’acquisition totale de 0,5 à 1 min
       REMARQUE : Assurez-vous que le taux d’acquisition est adapté de manière appropriée à la vitesse des filaments en mouvement. La fréquence d’images d’acquisition est un élément important à prendre en compte avant de collecter des données pour les utiliser avec des programmes de suivi. Les mouvements de sous-pixels entre les images entraîneront une surestimation de la vitesse, et des mouvements de plusieurs centaines de nanomètres sont nécessaires pour obtenir des valeurs précises. Un taux d’acquisition optimal se caractérise par un glissement de l’actine sur une distance d’au moins un pixel entre les images. Dans le cas du microscope TIRF utilisé ici pour l’imagerie, ce seuil se traduit par 130 nm ; Par conséquent, une myosine qui devrait se déplacer à 1 μm/s doit être imagée à une vitesse de 5 images/s (intervalle de 0,2 s) pour atteindre 200 NM de mouvement, tandis qu’une myosine qui devrait se déplacer à 10 nm/s nécessite 0,05 image/s (intervalles de 20 s). Les données peuvent donc être sous-échantillonnées à ce stade si nécessaire.

Tableau 1 : Tampons utilisés dans le test de vol plané

Nom de la mémoire tampon	Composition (M5a)	Composition (NM2b)	Étape(s) utilisée(s) (M5A/NM2B)	Commentaires
4X Tampon de motilité (4X Mo)	80 mM MOPS, pH 7,2	80 mM MOPS, pH 7,2		Aspire le filtre et stocke à 4°C
	20 mM MgCl2	20 mM MgCl2
	0,4 mM EGTA	0,4 mM EGTA
	pH 7,4	pH 7,4
50 mM Tampon de motilité du sel (50 mM MB)	25 % v/v 4 fois Mo	25 % v/v 4 fois Mo		Aspire le filtre et stocke à 4°C
	50 mM KCl	50 mM de NaCl
	Augmenter au volume avec dH2O	Augmenter au volume avec dH2O
500 mM Tampon de motilité du sel (500 mM MB)	N/A	25 % v/v 4 fois Mo		Aspire le filtre et stocke à 4°C
		500 mM de NaCl
		Augmenter au volume avec dH2O
Myosine	0,05-0,1 μM de myosine	0,2 μM de myosine	4.2	Restez sur la glace.
	1 mM de TNT	1 mM de TNT
	Diluer dans 50 mM MB	Diluer dans 500 mM MB
1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA)	1 mg/mL de BSA	1 mg/mL de BSA	4.3	Restez sur la glace.
	Diluer dans 50 mM MB	Diluer dans 500 mM MB
	1 mM de TNT	1 mM de TNT
5 μM F-actine non marquée en 50 mM MB (actine noire)	5 μM d’actine F non marquée	5 μM d’actine F non marquée	4.5	Restez sur la glace. Cisailler l’actine en pipetant de haut en bas 5 à 10 fois, ou à l’aide d’une seringue.
	1 μM de calmoduline (CaM)	1 mM d’ATP
	1 mM d’ATP	0,2 mM de CaCl2
	Diluer dans 50 mM MB	1 μM CaM
		Myosine kinase à chaînes légères 1-10 nM (MLCK)
		Diluer dans 50 mM MB
MB avec 1 mM TNT et 1 mM ATP	1 mM de TNT	1 mM de TNT	4.6	Restez sur la glace.
	1 mM d’ATP	1 mM d’ATP
	Diluer dans 50 mM MB	Diluer dans 50 mM MB
MB avec TNT	1 mM de TNT	1 mM de TNT	4.4, 4.7, 4.9	Garder sur la glace.
	Diluer dans 50 mM MB	Diluer dans 50 mM MB
20 nM Rhodamine-Phalloïdine F-actine (Rh-Actine)	20 nM de rhodamine-phalloïdine F-actine	20 nM de rhodamine-phalloïdine F-actine	4.8	Restez sur la glace. Ne faites pas de vortex.
	1 mM de TNT	1 mM de TNT
	Diluer dans 50 mM MB	Diluer dans 50 mM MB
Tampon final	50 mM KCl	0,7 % de méthylcellulose (facultatif)	4.10	Ajoutez le glucose, la glucose oxydase et la catalase immédiatement avant de réaliser l’expérience. Restez sur la glace.
	20 mM de MOUSSE, pH 7,2	50 mM de NaCl
	5 mM MgCl2	20 mM de MOUSSE, pH 7,2
	0,1 mM EGTA	5 mM MgCl2
	1 mM d’ATP	0,1 mM EGTA
	50 mM TNT	1 mM d’ATP
	1 μM de calmoduline	50 mM TNT
	2,5 mg/mL de glucose	1 à 10 nM MLCK
	100 μg/mL de glucose oxydase	0,2 mM de CaCl2
	40 μg/mL de catalase	1 μM de calmoduline
		2,5 mg/mL de glucose
		100 μg/mL de glucose oxydase
		40 μg/mL de catalase

Résultats

Figure 1 : Préparation de chambres de cellules d’écoulement fonctionnalisées. (A) Commencez avec une lame de microscope nettoyée, deux morceaux de ruban adhésif double face coupés à environ 2 cm et une lamelle fonctionnalisée. (B) Ajoutez le ruban adhésif au centre de la lame de microscope. (C) Fixez la lamelle sur le ruban avec le revêtement ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acétate d’amyle	Ladd Research Industries	Référence 10825
ATP	Millipore Sigma	A7699
Albumine sérique bovine	Millipore Sigma	Référence 5470
Calmoduline		PMID : 2985564
catalase	Millipore Sigma	C40
Papier filtre circulaire - Essai de glissement	Millipore Sigma	WHA1001125
Porte-couvercle	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Lamelles : dosage du filament à glissement	VWR International	Référence 48366-227
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	D0632
Ruban adhésif double face	Dépôt de bureaux	909955
EGTA	Millipore Sigma	E4378
éthanol	Fischer Scientific	N° A4094
G-actine		PMID : 4254541	Le stock de G-actine peut être stocké à 200 μM dans du N2 liquide.
glucose	Millipore Sigma	Référence G8270
Glucose oxydase	Millipore Sigma	G2133
Kcl	Fischer Scientific	Réf. P217-500
Pointes de pipette à grand orifice	Fischer Scientific	Tél. : 02-707-134
Méthylcellulose	Millipore Sigma	M0512
Lames de microscope	Fischer Scientific	Référence : 12-553-10
Vadrouilles	Fischer Scientific	BP308-100
nitrocellulose	Ladd Research Industries	Référence 10800
Lames de rasoir	Dépôt de bureaux	397492
Rhodamine-Phalloïdine	ThermoFisher Scientific	R415	Le stock peut être dilué dans du méthanol à 100 % jusqu’à une concentration finale de 200 μM.
Boîte de culture tissulaire - Essai de glissement	Corning	353025	Chaque boîte de culture tissulaire peut contenir environ neuf lamelles.
Pointes de pipette à parois lisses de 200 μL	Thomas Scientific	Référence 1158U38
équipement
centrifugeuse	ThermoFisher Scientific	75006590
microscope	Nikon	Modèle : Eclipse Ti avec système H-TIRF avec objectif 100x TIRF (N.A. 1.49)
Caméra microscope	Andor	Modèle : Caméra iXon DU888 EMCCD (format de capteur 1024 x 1024)
Boîtier de contrôle de l’environnement du microscope	Frappe de Tokai	Boîte isotherme personnalisée
Unité laser microscope	Nikon	LU-n4 Unité laser à quatre lasers avec lasers à semi-conducteurs pour 405 nm, 488 nm, 561 nm et 640 nm
Ultracentrifugeuse de table Optima Max-XP	Beckman Coulter	393315