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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local
1. Sensibilisation passive des cellules huRBL
- Centrifuger l’Ag8/suspension sérique pré-incubée pendant 5 min à 250 x g.
- Transférez 50 μL de la suspension sérique d’Ag8 centrifugée dans chaque puits contenant des cellules huRBL sans perturber la pastille de cellules Ag8.
- Inclure le contrôle sans antigène, qui sont des cellules sensibilisées, mais non stimulées (n’ajoutez pas d’antigène), servant d’indication pour le plateau/fond de signal inférieur. Les puits de contrôle de fond et de lyse maximale n’ont pas besoin d’être sensibilisés avec du sérum. Ajouter plutôt 50 μL de milieu huRBL pour contrôler les puits.
- Couvrez la plaque avec le couvercle et laissez incuber toute la nuit à 37 °C et 5 à 7 % de CO2.
2. Dégranulation stimulée par l’antigène et libération du médiateur
- Préparez à l'avance la dilution de l'antigène dans 1 tampon de Tyrode (sels de Tyrode 9,5 g/L, albumine sérique bovine (BSA) à 0,1 %, hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3) 0,5 g/L en dH2O). Une quantité finale de 100 μL par puits est nécessaire.
note: Tous les allergènes, qu'ils soient purifiés à partir de sources naturelles ou produits de manière recombinante, ne sont pas nécessairement stables dans le tampon 1x Tyrode. Par conséquent, effectuez des tests de stabilité dans le tampon 1x Tyrode avant la procédure de test. Alternativement, diluez 1x le tampon de Tyrode dans de l'oxyde de deutérium (D2O) pour augmenter le rapport signal/bruit du test.
- Effectuer 8 dilutions de l’antigène d’intérêt d’une série de dilutions de 1:10 dans des tubes réactionnels commençant par 10 ou 1 μg/mL de protein.
REMARQUE : Testez toujours la série de dilution au préalable. Vous pouvez également adapter la série de dilution 1:10 (p. ex., 1:5, 1:20 ou 1:30) pour couvrir toute la courbe de relâchement. De plus, la concentration de départ peut varier en fonction de la configuration expérimentale.
- Pour laver les cellules huRBL plaquées sur la plaque à 96 puits, retirez d’abord le milieu cellulaire contenant des sérums en aspirant, inversant et tapotant soigneusement la plaque sur du papier absorbant.
- Laver les cellules avec 200 μL de 1x tampon Tyrodes par puits. Traitez tous les puits de la même manière.
note: Ajoutez lentement la solution de lavage dans les cellules pour ne pas les déranger.
- Laissez-le pendant environ 30 s et répétez l’étape de lavage trois fois au total.
- Après avoir ajouté la solution de lavage pour la dernière fois, laissez la solution dans les puits jusqu’au moment de continuer avec l’ajout de la dilution de l’antigène.
note: Évitez d’exposer les cellules à l’air trop longtemps.
- Transférez 100 μL de solution d’antigène dans chaque puits contenant les cellules huRBL présensibilisées.
REMARQUE : En cas d’analyse de plusieurs paramètres différents, transférez les échantillons individuels de la série de dilution dans une plaque supplémentaire non contraignante à 96 puits (utilisez la même disposition que sur la plaque huRBL) et transférez-les ensuite avec une pipette multicanaux directement sur la plaque cellulaire huRBL. De cette façon, il est possible d’éviter d’exposer les cellules à l’air pendant trop longtemps, ce qui pourrait entraîner de mauvaises performances de test (signal faible/inexistant).
- Couvrir les puits de contrôle (cellules de lyse maximale et cellules de fond non sensibilisées) avec 100 μL de 1x tampon de Tyrode. Ne stimulez pas ces puits de contrôle avec l’antigène.
- De plus, ajoutez 100 μL de tampon 1x Tyrode dans les puits sans antigène sensibilisés de la série de dilution, ce qui est nécessaire pour prendre en compte la libération spontanée indépendante de l'antigène des cellules sensibilisées lors de l'analyse des données.
- Incuber les cellules huRBL pendant 1 h à 37 °C et 5 % à 7 % de CO2.
3. Mesure en fluorescence de l’activité de la β-hexosaminidase
- Traiter les puits du contrôle de lyse maximal avec 10 μL de 10 % de Triton X-100 par puits et mélanger correctement afin de lyser complètement les cellules et d’obtenir la libération de 100 % de β-hexosaminidase.
- Ajouter 50 μL de solution de substrat dans une nouvelle plaque non contraignante à 96 puits. Solution de substrat pour une plaque de 96 puits : 5 mL de tampon d’essai citrique 0,1 M, pH 4,5 ; et 80 μL de N-acétyl-β-D-glucosaminide de 4-méthylumbellifère.
- Transférez 50 μL de surnageant cellulaire de tous les puits vers la nouvelle plaque contenant la solution de substrat.
REMARQUE : Pipeter soigneusement le surnageant hors de la plaque huRBL pour ne pas perturber les cellules huRBL.
- Incuber la plaque avec une solution de substrat et un surnageant cellulaire pendant 1 h à 37 °C pour permettre la conversion du substrat fluorogène.
note: Conservez la plaque huRBL pour le test de viabilité cellulaire.
- Ajouter 100 μL de solution d’arrêt (15 g/L de glycine, 11,7 g/L de NaCl dissous dans dH2O, pH 10,7) par puits.
- Mesurez la fluorescence à une excitation de 360 nm et une émission de 465 nm à l’aide d’un lecteur de plaques.