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1. Dépistage à haut débit par inhibition de croissance (HTS)
REMARQUE : L’activité inhibitrice de croissance des agents anticancéreux contre les organoïdes tumoraux dérivés de patients (DO) est évaluée en mesurant la teneur en ATP intracellulaire, comme le montre la figure 1. Cette étape est réalisée à l’aide d’un kit d’analyse de viabilité cellulaire disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
- Le jour 0, cultiver les AOP (p. ex., RLUN007) dans des flacons jusqu’à ce qu’un nombre suffisant d’amas de cellules soit disponible pour l’essai. Un jour avant l’ensemencement, transvaser la suspension PDO d’une fiole de2 cm dans un tube de 15 mL et centrifuger à 200 x g pendant 2 min pour mesurer le volume de granulés PDO. Ensuite, remettre la pastille AOP en suspension dans 15 mL de milieu frais et la remettre dans une fiole de75 cm 2. Cultiver les cellules à 37 °C dans 5 % CO2.
note: Le volume de pastilles PDO requis dépend du taux de dilution de chaque PDO et du nombre de plaques de 384 puits utilisées pour le test. Pour RLUN007, un volume de granulés cellulaires de 200 μL est nécessaire pour l’ensemencement dans dix plaques de 384 puits.
- Le jour 1 (24 h après le changement de milieu), hachez les AOP à l’aide d’un équipement de fragmentation et de dispersion cellulaire (voir tableau des matériaux) avec un porte-filtre contenant un filtre à mailles de 70 μm. Ensuite, diluez 15 mL de suspension PDO par 10x. Semez 40 μL de la suspension PDO dans des microplaques sphéroïdes à très faible fixation (à fond rond) de 384 puits (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un distributeur de suspension cellulaire (voir le tableau des matériaux).
note: Pour hacher des amas de cellules, il est recommandé d’utiliser l’équipement de fragmentation et de dispersion cellulaire disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
- 24 h après l’ensemencement (jour 2), traiter les AOP avec 0,04 μL de solutions d’agent d’essai dans des plages de concentration finale de 20 μM à 1,0 nM (10 dilutions en série) à l’aide d’un manipulateur de liquide (voir le Tableau des matières).
- Le jour 8 (144 h après le traitement de la substance d’essai), ajouter le réactif de mesure de l’ATP intracellulaire dans les puits d’essai. Mélanger les plaques à l’aide d’un mélangeur et incuber pendant 10 min à 25 °C. Mesurer la teneur en ATP intracellulaire sous forme de luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques (voir Tableau des matériaux).
- Pour calculer la viabilité de la cellule, il faut diviser la quantité d’ATP dans les puits d’essai par celle dans les puits de contrôle contenant le véhicule, en soustrayant le bruit de fond. Pour calculer le taux de croissance sur 6 jours, il faut diviser la quantité d’ATP dans les puits de contrôle du véhicule par celle dans les puits de contrôle du véhicule 24 h après l’ensemencement.
- Calculer les valeurs de concentration inhibitrice à 50 % (CI50) et d’aire sous la courbe (AUC) à partir des courbes dose-réponse à l’aide d’un logiciel d’analyse de données biologiques (voir Tableau des matériaux). Le facteur Z est un paramètre sans dimension qui va de 1 (séparation infinie) à <0, défini comme Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, où σc+, σc-, μc+ et μc- sont les écarts-types (σ) et les moyennes (μ) des contrôles haut (c+) et bas (c−), respectivement.
