Action capillaire radiale différentielle du dosage du ligand : une technique à haut débit pour identifier les protéines intracellulaires de liaison au second messager du nucléotide bactérien

Résumé

Source : Schicketanz, M. L., et al. Identification des protéines de liaison des petits ligands avec l’action capillaire radiale différentielle du dosage des ligands (DRaCALA). J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo démontre l’action capillaire radiale différentielle du dosage des ligands, une technique de criblage systématique à haut débit des protéines de liaison du second messager du nucléotide intracellulaire. Cette technique permet de lier directement les messagers à la protéine cible surexprimée dans le lysat cellulaire, sans avoir à se purifier des protéines.

Protocole

1. Préparation des lysats de cellules entières

1. Inoculer les souches de collection E. coli K-12 ASKA ORFeome dans un bouillon de lysogénie (LB) de 1,5 mL contenant 25 μg/mL de chloramphénicol dans des plaques à puits profonds de 96 puits. Cultiver pendant une nuit (non/nuit) pendant 18 h à 30 °C en secouant à 160 tr/min. Le lendemain, ajouter de l’isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (0,5 mM final) aux cultures O/N pour induire l’expression des protéines à 30 °C pendant 6 h.
2. Cellules à granulés à 500 x g pendant 10 min. Congelez les granulés à -80 °C jusqu’à utilisation. Pour lyser les cellules, ajoutez 150 μL de tampon de lyse L1 (40 mM de Tris pH 7,5, 100 mM de NaCl, 10 mM de MgCl₂, complété par 2 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 40 μg/mL de DNase 1 et 0,5 mg/mL de lysozyme) pour remettre la pastille en suspension.
3. Congelez les cellules à -80 °C pendant 30 min, puis décongelez-les à 37 °C pendant 20 min. Répétez ce cycle trois fois pour lyser les cellules. Conservez les lysats à -80 °C avant utilisation.

2. Purification de Rel_seq et GppA

REMARQUE : Les protéines recombinantes Rel_seq de Streptococcus equisimilis et GppA d’E. coli K-12 sont utilisées pour synthétiser respectivement les protéines radiomarquées pppGpp et ppGpp.

1. Cultivez et collectez des cellules surexprimant chaque protéine.
   1. Cultiver la souche E. coli BL21 DE3 jusqu’à la phase exponentielle (densité optique (DO) ~0,3-0,4) dans un bouillon LB, et faire tourner 1 mL de culture à 6000 x g pendant 5 min. Décanter le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 100 μL de bouillon TSB glacé (bouillon LB complété par 0,1 g/mL de PEG3350, 0,05 mL/mL de diméthylsulfoxyde, 20 mM MgCl₂).
   2. Mélangez les plasmides portant le relseq et le gppA marqués à l’histidine, chacun 100 ng, avec les suspensions cellulaires ci-dessus dans TSB, et incubez sur de la glace pendant 30 min. Électrocutez les cellules à 42 °C pendant 40 s. Placez le mélange sur de la glace pendant 2 min et ajoutez 1 mL de bouillon LB à température ambiante pour permettre aux cellules de récupérer pendant 1 h à 37 °C avec agitation à 160 tr/min.
   3. Déposer les cellules récupérées sur des plaques de gélose LB complétées par les antibiotiques correspondants (Rel_seq : 100 μg/mL d’ampicilline ; GppA : 30 μg/mL de kanamycine). Le lendemain, inoculer les colonies dans un bouillon LB pour commencer les précultures O/N des deux souches à 37 °C.
   4. Après 18 h, inoculer 500 ml de milieu LB avec 10 ml de cultures O/N et les antibiotiques correspondants. Cultivez les cultures en les secouant à 160 tr/min à 37 °C. Lorsque la DO_{de 600 nm} atteint 0,5-0,7, induire l’expression de la protéine en ajoutant 0,5 mM d’IPTG et en augmentant pendant 3 h à 30 °C avec agitation à 160 tr/min.
   5. Prélever les cellules en les faisant tourner à 6084 x g pendant 10 min à 4 °C. Remettre la pastille en suspension dans 20 mL de solution saline glacée 1x tamponnée au phosphate (PBS) et la centrifuger à 1912 x g pendant 20 min à 4 °C. Décanter le surnageant et congeler les pastilles à -20 °C avant utilisation.
2. Purification par affinité de l’acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA)
   note: À partir de ce moment, assurez-vous que les échantillons sont froids.
   1. Ajouter 40 mL de tampon de lyse glacé L2 (50 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 5 % de glycérol, 10 mM d’imidazole, 10 mM de β-mercaptoéthanol complété par des inhibiteurs de protéase (comprimé sans EDTA ; voir le tableau des matériaux) pour remettre la pastille en suspension. Lyse des cellules par sonication (amplitude de 60 %, 2 s ON / 4 s OFF pendant 8 min ON). Éliminez le lysat en tournant à 23 426 x g pendant 40 min à 4 °C, et continuez avec le surnageant pour la purification.
   2. Au cours de la centrifugation ci-dessus, préparez la résine Ni-NTA.
      1. Transférez 500 μL de résine Ni-NTA homogénéisée dans une colonne de chromatographie en polypropylène sur pied, et laissez-la reposer pendant 15 minutes et la solution de stockage s’écoulant. Lavez deux fois la résine avec 15 ml d’eau ultrapure, puis lavez la colonne avec 15 ml du tampon de lyse L2.
   3. Chargez le surnageant éliminé de lysat cellulaire de l’étape 1 sur la colonne et laissez-le s’écouler. Laver la colonne avec 30 mL de tampon de lavage (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 % de glycérol, 20 mM d’imidazole).
   4. Éluer les protéines avec 400 μL de tampon d’élution (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 % de glycérol, 500 mM d’imidazole) trois fois. Ensuite, répétez l’élution avec 300 μL supplémentaires du tampon d’élution. Combinez les protéines éluées jusqu’à un volume final de 700 μL.
3. Filtration sur gel
   1. Préparez un tampon de filtration sur gel (50 mM Tris, pH 7,5 ; 200 mM NaCl ; 5 % de glycérol). Lavez la colonne d’exclusion de taille avec un volume de colonne (25 ml) de tampon de filtration sur gel.
   2. Chargez l’échantillon de 700 μL ci-dessus à l’aide d’une boucle de 500 μL, exécutez à 0,5 ml/min et collectez 2-3 fractions, chacune d’un volume de 0,5 ml, contenant les protéines respectives.
   3. Combinez et concentrez les fractions contenant chacune des protéines à l’aide d’une colonne de spin, et mesurez la concentration en protéines à l’aide du test Bradford.

3. Synthèse de ³²pppGpp et ppGpp marqués au P

1. Assemblez une réaction Rel_seq à petite échelle dans un tube à bouchon à vis (voir Tableau 1).
   note: Ne travaillez avec des réactifs radioactifs que dans un endroit autorisé et avec de l’équipement de protection individuelle.
2. Incuber le tube à 37 °C dans un thermomélangeur pendant 1 h, puis à 95 °C pendant 5 min, et le placer sur de la glace pendant 5 min. Faites tourner la protéine précipitée à 15 700 x g pendant 5 min, et transférez le surnageant (synthétisé ³²P-pppGpp) dans un nouveau tube à bouchon à vis.
3. Pour synthétiser ³²P-ppGpp à partir de ³²P-pppGpp, transférez la moitié du produit ³²P-ppppGpp dans un nouveau tube à bouchon à vis et ajoutez 1 μM GppA. Incuber le tube à 37 °C pendant 10 min, à 95 °C pendant 5 min, puis le placer sur de la glace pendant 5 min.
4. Faites tourner la protéine précipitée à 15 700 x g pendant 5 min et transférez le surnageant (synthétisé ³²P-ppGpp) dans un nouveau tube à bouchon à vis.
5. Analysez les ^{échantillons 32}P-pppGpp et ³²P-ppGpp en soumettant 1 μL des échantillons sur une plaque de chromatographie sur couche mince (CCM) (plaques CCM de cellulose modifiée à la polyéthylèneimine) en utilisant le 1,5 M KH₂PO₄, pH 3,4, en phase mobile.
   note: Utilisez la guanosine 5'-triphosphate marquée au ^α-32P (³²P-α-GTP) comme contrôle.
6. Séchez complètement la plaque TLC, placez-la dans une chemise en plastique transparent et exposez-la à un écran de stockage au phosphore pendant 5 min. Visualisez et quantifiez les signaux à l’aide d’un phosphorimager.
   note: Lorsque les rapports de ³²P-pppGpp et ³²P-ppGpp sont supérieurs à 85 %, une réaction à grande échelle (500 μL, suffisante pour le criblage de 20 plaques de 96 puits) a pu être assemblée et synthétisée à l’aide du tableau 1.

4. Criblage DRaCALA des protéines cibles de (p)ppGpp

1. Décongelez et transférez 20 μL de lysats de cellules entières dans une plaque de microtitration à fond en V de 96 puits. Ajouter 2,5 U/puits de l’endonucléase de Serratia marcescens et incuber à 37 °C pendant 15 min pour réduire la viscosité du lysat. Placez les lysats sur de la glace pendant 20 min.
2. Mélangez les ³²P-pppGpp et ³²P-ppGpp dans un rapport de 1:1, et ajoutez 1x tampon de lyse L1 pour obtenir une concentration finale de (p)ppGpp égale à 4 nM.
   note: Étant donné la similitude chimique entre le pppGpp et le ppGpp, un mélange des deux produits chimiques simplifiera le processus de dépistage.
3. À l’aide d’une pipette multicanaux et d’embouts de pipette filtrés, ajoutez et mélangez 10 μL du mélange (p)ppGpp avec le lysat cellulaire. Incuber à température ambiante (RT) pendant 5 min.
4. Lavez l’outil à goupille 96 x en le plaçant dans une solution à 0,01 % de détergent non ionique pendant 30 s, et séchez-le sur du papier de soie pendant 30 s. Répétez le lavage de l’outil à goupille 3 fois.
5. Placez l’outil à goupille dans les plaques d’échantillon à 96 puits ci-dessus et attendez 30 s. Soulevez l’outil à goupille vers le haut et placez-le vers le bas sur une membrane de nitrocellulose pendant 30 s.
   note: S’il manque un point, repérez 2 μL des échantillons correspondants à l’aide d’une pipette et d’embouts filtrés. Il est conseillé de faire une copie du même échantillon comme indiqué ci-dessous.
6. Séchez la membrane pendant 5 min à RT. Placez la membrane entre une chemise en plastique transparent et exposez-la à un écran de stockage au phosphore pendant 5 min. Visualisez à l’aide d’un imageur phosphore.

5. Quantification et identification de protéines cibles potentielles

1. Utilisez le logiciel d’analyse associé au phosphorimager pour ouvrir le fichier .gel des plaques visualisées. Utilisez la fonction d’analyse de réseau pour définir les 96 points en configurant une grille de 12 colonnes x 8 lignes.
2. Définissez de grands cercles pour circonscrire le bord extérieur de l’ensemble des taches (voir Figure 1). Exportez le volume+arrière-plan et la surface des grands cercles définis, et enregistrez-les dans une feuille de calcul.
   note: Si nécessaire, repositionnez chaque cercle individuel pour qu’il se chevauche parfaitement avec les taches, et redimensionnez chaque cercle individuel pour le rendre légèrement plus grand que le spot réel.
3. Réduisez la taille des cercles définis pour circonscrire les petits points intérieurs. Exportez le volume+arrière-plan et la surface des petits cercles définis et enregistrez-les dans une feuille de calcul.
4. Calculez les fractions de liaison dans la feuille de calcul à l’aide de l’équation de la figure 1 et tracez les données. Identifiez les protéines de liaison potentielles dans les puits qui présentent des fractions de liaison élevées par rapport à la majorité des autres puits.

Tableau 1 : Assemblage d’informations pour les réactions de synthèse à petite et grande échelle de ³²pppGpp marqués au P. *10x Le tampon Relseq contient 250 mM de Tris-HCl, pH 8,6 ; 1M de NaCl ; 80 mM de MgCl₂. Abréviation : pppGpp = guanosine pentaphosphate.

	Volume (μL)
	Petite échelle	Grande échelle
Eau ultra-pure
10x tampon Relseq*	deux	50
ATP (finale 8 mM)
Relseq (4 μFinale M)
32P-α-Guanosine triphosphate (GTP) (120 nM final) (ATTENTION)	0,2	5
total	20	500

Résultats

Figure 1 : Quantification et calcul de la fraction de liaison. Voir le texte pour plus de détails. Brièvement, les taches DRaCALA seront analysées en dessinant deux cercles qui circonscrivent l’ensemble de la tache et le point sombre interne (c’est-à-dire le (p)ppGpp conservé en raison de la liaison de la protéine testée). Le signal de liaison spécifique est le signal radioactif du ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
32P-α-GTP	Perkinélmer	BLU006X250UC
96 x outil à goupille	V&P Scientifique	VP 404	Réplicateur de boulons 96, sur des centres de 9 mm, diamètre de boulon de 4,2 mm, longueur de 24 mm
Plaque de microtitration à fond en V de 96 puits	Stérilisine	MIC9004	Sterilin Microplaque V Well 611V96
agar-agar	OXOID - Thermo Fisher	LP0011 (en anglais	Agar n° 1
Souche de collection ASKA	NBRP, SHIGEN, JAPON		Réf. : DNA Research, volume 12, numéro 5, 2005, pages 291-299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
Benzonase	sigma	E1014-25KU	endonucléase génétiquement modifiée de Serratia marcescens
Colorant d’analyse des protéines Bradford	Bio-Rad	5000006	Concentré de réactifs
Dmso	sigma	D8418	≥99,9 %
DNase 1	sigma	DN25-1G
filtration sur gel10x300 colonne	GE Soins de santé	28990944	Contient 20 % d’éthanol comme conservateur
glycérol	PanReac AppliChem	Référence 122329.1214	Glycérol 87 % pour l’analyse
Hypercassette	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
Imidazole	sigma	Référence 56750	puriss. p.a., ≥ 99,5 % (GC)
Ecran phosphore de stockage IP	FUJIFILM	28956474	BAS-MS 2040 20x 40 cm
Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	sigma	I6758	Isopropyl β-D-thiogalactoside
Bouillon de lysogénie (LB)	Invitrogen - Thermo Fisher	12795027	Base de bouillon Miller's LB
lysozyme	sigma	N° L4949	du blanc d’oeuf de poule ; BioUltra, poudre lyophilisée, ≥98 %
MgCl2 (chlorure de magnésium)	sigma	208337
Eau MilliQ			Eau ultrapure
Pipette multicanaux	Thermo Scientific	4661110	F1 - Embout de clip ; 1-10 ul, 8 x canaux
NaCl	Produits chimiques VWR	Référence 27810	AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Agarose Ni-NTA	Qiagen	Référence 30230
Membrane buvard nitrocellulosique	Amersham Protran	10600003	Premium 0,45 um 300 mm x 4 m
Pbs	OXOID - Thermo Fisher	BR0014G	Solution saline tamponnée au phosphate (Dulbecco A), comprimés
PEG3350 (Polyéthylène glycol 3350)	sigma	202444
fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)	sigma	Référence 93482	Solution de fluorure de phénylméthanesulfonyle - 0,1 M dans de l’éthanol (T)
Imageur au phosphore	GE Soins de santé	28955809	Typhoon FLA-7000 Imageur phosphorescent
Pointes de pipette, filtrées	Thermo Scientific	94410040	ClipTip 12,5 μl non stérile
Colonne de chromatographie Poly-Prep	Bio-Rad	7311550	Colonne de chromatographie en polypropylène
Inhibiteur de protéase Mini	percer	Réf. A32955	Comprimés, sans EDTA
Tube à bouchon à vis	Thermo Scientific	Référence 3488	Tubes Microcentifuge, 2,0 ml avec bouchon à vis, non stériles
Plaques à puits SLS 96 de profondeur	Greiner	780285	MASTERBLOCK, 2 ML, PP, FOND EN V, Naturel
Colonne de rotation	Millipore	UFC500396	Filtres centrifuges Amicon Ultra -0,5 ml
Thermomélangeur	Eppendorf	5382000015	Thermomélangeur C
Plaque TLC (plaques PEI-cellulose F TLC)	Merck Millipore	105579	DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)
Tris	sigma	BP152	Base Tris pour la biologie moléculaire
Préadolescent 20	sigma	Réf. P1379	détergent visqueux non ionique
β-mercaptoéthanol	sigma	M3148	99 % (GC/titrage)

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