Dosage par sonde fluorescente : une technique pour visualiser le stress oxydatif dans les cellules organoïdes intestinales en culture traitées par des inducteurs d’espèces réactives de l’oxygène

Résumé

Source : Stedman, A. et al., Analyse du stress oxydatif dans les organoïdes intestinaux murins à l’aide d’une sonde fluorogénique sensible aux espèces réactives en oxygène. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo décrit la technique de visualisation du stress oxydatif dans les organoïdes en culture. Ce travail aide à comprendre le niveau de stress oxydatif dû à l’accumulation de ROS dans les différents types de cellules présentes dans un organoïde après un traitement avec différents modulateurs de ROS.

Protocole

1. Visualisation du stress oxydatif dans les organoïdes 3D par microscopie confocale

1. Prenez les organoïdes plaqués dans les chambres à puits μ-Slide 8 et ajoutez 1 μL de N-acétylcystéine ou de solution mère NAC dans les puits correspondants pour obtenir une concentration finale de 1 mM.
2. Incuber pendant 1 h à 37 °C et 5 % CO₂.
3. Ajouter 1 μL de solution mère de BHP dans les puits correspondants pour obtenir une concentration finale de 200 μM.
4. Incuber pendant 30 min à 37 °C et 5 % de CO₂.
5. Ajouter 1 μL par puits de la dilution de 1,25 mM de la sonde fluorogène pour obtenir une concentration finale de 5 μM.
6. Ajouter 1 μL par puits de la dilution de 1,25 mg/mL de Hoechst pour obtenir une concentration finale de 5 μg/mL.
7. Incuber pendant 30 min à 37 °C et 5 % de CO₂.
8. Retirez le fluide sans déranger le BMM. Ajouter délicatement 250μL de DMEM tiède sans rouge de phénol.
   note: Si une acquisition à long terme est prévue, ajouter des composés de facteurs de croissance au DMEM sans rouge de phénol.
9. Imagez les organoïdes à l’aide d’un microscope confocal équipé d’une chambre thermique et d’une alimentation en gaz qui détecte la sonde fluorogénique (ROS).
   note: L’excitation/émission (ex/em) pour la sonde fluorogénique est de 644/665, ex/em pour Hoechst (noyaux) est de 361/486 et ex/em pour la GFP (cellule souche intestinale des souris Lgr5-GFP) est de 488/510. Un objectif d’immersion dans l’huile 63x est utilisé pour détecter les signaux dans les cellules souches. Ne modifiez pas les paramètres laser entre les échantillons. Un objectif 20x peut être utilisé pour permettre une vue d’ensemble de la production de ROS.
10. Utilisez la commande positive pour configurer l’intensité laser et le temps d’exposition du signal ROS et vérifiez que ce signal est plus faible dans la commande négative.
11. À l’aide de l’oculaire, examinez la lame pour identifier les organoïdes GFP exprimant et ajustez l’intensité du laser.
    note: Cette étape est effectuée manuellement.
12. Définissez les positions pour obtenir une image assemblée de l’organoïde entier. Configurez une pile z de 25 μm (pas de 5 μm) pour obtenir une section des organoïdes montrant une couche de cellules.
    note: Reportez-vous au manuel d’utilisation du microscope pour optimiser la configuration. À l’aide de cellules vivantes, l’acquisition doit être effectuée dans les 1 h suivant la fin de l’incubation.
13. Ouvrez les images dans un logiciel de traitement d’images open source (voir la Table des matériaux).
14. Parcourez la pile z et choisissez la section dans laquelle le milieu des organoïdes est bien représenté et créez une nouvelle image avec la zone sélectionnée.
15. Quantifiez les images en suivant les étapes suivantes.
    1. Sélectionnez l’outil de ligne à main levée.
    2. Tracez une ligne le long du nuclei.
       note: Ne sélectionnez que les régions présentant des cellules GFP positives si seules les cellules souches sont analysées.
    3. Augmentez la largeur de la ligne pour couvrir la couche cellulaire avec la ligne sans inclure les débris luminaux.
    4. Sélectionnez le canal pour le signal ROS et mesurez l’intensité de fluorescence dans la région sélectionnée et annotez les valeurs.
    5. Tracez une ligne où il n’y a pas de signal et mesurez l’intensité fluorescente de l’arrière-plan qui sera soustraite de la valeur précédente pour obtenir l’intensité finale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
souris
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5- GFP)	Le Laboratoire Jackson
Milieu de culture de croissance
DMEM avancé F12 (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
Pénicilline-streptomycine (P/S)	ThermoFisher	15140122	Concentration de la matrice : 100x (10 000 unités/mL de pénicilline et 10 000 μg/mL de streptomycine)
FLuoroBrite DMEM (DMEM sans rouge de phénol)	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	ThermoFisher	N° H3570	bouillon à 10 mg/mL
Facteur de croissance du matrigel réduit, sans rouge de phénol (matrice de membrane basale)	Corning	356231	une fois reçu, décongeler O/n au réfrigérateur, conserver 1h sur de la glace et, faire 500 mL d’aliquotes et conserver à -20 °C
μ-Slide 8 Chambres à puits	Ibidi	Référence 80826
N-acétylcystéine (NAC)	sigma	A9165
solution d’hydroperoxyde de tert-butyle (tBCHP) (70 % en poids. En H2O2)	sigma	458139
Programmes et équipement
Fidji/ImageJ			https://imagej.net/software/fiji/ téléchargements génération d’images
Observateur.Z1	Zeiss		système confocal
Opterra (confocaux à champ balayé)	Bruker		système confocal
Caméra EMCCD haute vitesse Evolve Delta 512	Photométrie		système confocal
prisme	Logiciel GraphPad		analyse statistique