Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de réactifs et de matériaux pour la culture d’organoïdes intestinaux
- Pour préparer le milieu de culture de croissance, mélanger du DMEM/F-12 avancé complété par 1 solution de glutamine, 1 solution de pénicilline et de streptomycine (P/S), 10 mM d’HEPES, 50 ng/mL d’EGF murin, 20 μg/mL de Noggin murin, 500 ng/mL de R-Spondin1 de souris (voir le tableau des matières). Laisser le milieu à température ambiante (RT) pendant l'extraction de la crypte.
note: Congelez le milieu inutilisé dans des aliquotes à -20 °C. Évitez de geler et de décongeler.
- Remplissez un tube de 50 ml avec 40 ml de DMEM/F-12 avancé et gardez-le sur de la glace.
note: Maintenez le fluide inutilisé à 4 °C. Il sera utilisé pour le passage des organoïdes.
- Préchauffez les plaques de culture cellulaire (fond rond à 96 puits) dans l’incubateur à 37 °C.
- Dégeler les aliquotes de matrice membranaire basale (voir Tableau des matériaux) sur glace (avant de commencer le protocole ou au moins 1 h avant le placage des cryptes).
note: Le BMM se solidifiera rapidement s’il n’est pas conservé au froid.
- Préparez la solution de lavage/rinçage en ajoutant une solution de pénicilline-streptomycine à 1 % à la DPBS (DPBS-P/S).
- Remplissez une boîte de Petri de 100 mm avec 10 ml de DPBS-P/S froid. Remplissez six tubes de 15 ml avec 10 ml de DPBS et étiquetez-les de F1 à F6.
- Préparer 30 mL de solution d’EDTA à 10 mM par dilution à partir de 0,5 M d’EDTA dans le DPBS. Remplissez deux tubes de 15 ml avec 10 ml d’EDTA de 10 mM et étiquetez-les E1 et E2.
- Gardez toutes les solutions pré-refroidies à 4 °C et conservez-les sur la glace pendant la procédure.
2. Culture d’organoïdes intestinaux
- Sacrifiez une souris Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) âgée de 8 à 10 semaines conformément aux règles et réglementations nationales.
- Prélever 5 à 8 cm du jéjunum englobant la région entre le duodénum (à 5 cm de l’estomac) et l’iléon (à 10 cm du caecum et conserver dans le DPBS-P/S froid sur de la glace.
- Nettoyez le contenu intestinal en rinçant avec 5 à 10 ml de DPBS-P/S.
note: Des seringues de rinçage faites maison peuvent être obtenues en insérant un embout de 200 μL sur un embout de seringue de 10 mL.
- Ouvrez l’intestin longitudinalement à l’aide de ciseaux à bille (voir Tableau des matériaux) (pour éviter d’endommager les tissus).
- À l’aide d’une pince, transférez le tissu dans une boîte de Pétri contenant du DPBS-P/S froid à température ambiante et secouez-le pour rincer.
- À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, saisissez l’intestin par aspiration et transférez-le dans un tube de 15 mL étiqueté E1 contenant 10 mL d’EDTA froid de 10 mM.
- Retournez le tube 3 fois et incubez sur de la glace pendant 10 min.
- À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, transférez le tissu dans le tube F1 contenant 10 mL de DPBS. Vortex pendant 2 min (sur un vortex normal, en tenant le tube à la main et en s’assurant que l’intestin tourbillonne bien).
- Mettez 10 μL de la fraction dans une boîte de Pétri et évaluez la qualité de la fraction au microscope.
note: Toutes les étapes du vortex sont effectuées à la vitesse maximale, et la qualité de chaque fraction doit être évaluée au microscope (figure 1).
- À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, saisir l’intestin par aspiration et le transférer dans le tube F2 contenant 10 mL de DPBS et de vortex pendant 2 min.
- Répétez l’étape 2.10 en transférant le tissu dans le tube F3 contenant 10 mL de DPBS et un vortex pendant 2 min.
- Répéter l’incubation de l’EDTA comme à l’étape 2.6, en transférant le tissu dans le tube E2 contenant 10 mM d’EDTA.
- Retournez le tube 3 fois et incubez sur de la glace pendant 5 min.
- Répétez l’étape 2.10 en transférant le tissu dans le tube F4 contenant 10 mL de DPBS et un vortex pendant 3 min.
- Répéter l’étape 2.14 et transférer le tissu dans le tube F5 contenant 10 mL de DPBS et un vortex pendant 3 min.
- Répétez l’étape 2.15 en transférant le tissu dans le tube F6 contenant 10 mL de DPBS et un vortex pendant 3 min.
- Combinez les meilleures fractions en filtrant par gravité à travers une crépine de 70 μm dans un tube de 50 mL (sur glace) pour éliminer les villosités et les débris importants.
note: Habituellement, F5 et F6 sont les fractions contenant de nombreuses cryptes et moins de débris.
- Faites tourner les cryptes à 150 x g à 4 °C pendant 3 min.
- Videz le tube, perturbez mécaniquement la pastille et ajoutez 5 ml de DMEM/F12 froid.
- Mettez 10 μL de suspension dans une boîte de Pétri et comptez manuellement au microscope le nombre de cryptes présentes dans l’aliquote.
note: Ne comptez pas les cellules individuelles ou les petits débris.
- Calculez le volume (V) de suspension des cryptes requis en μL, en considérant que 300 cryptes sont plaquées par puits, W est le nombre de puits et N est le nombre de cryptes comptées sur 10 μL de suspension. Transférez les cryptes dans un nouveau tube de 15 mL.
note: V = 300 x l x 10/N. Si un petit volume est utilisé dans l’expérience prévue, un tube à centrifuger de 1,5 mL peut être utilisé.
- Faites tourner les cryptes à 200 x g à 4 °C pendant 3 min.
- Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Perturber mécaniquement la pastille et ajouter délicatement du milieu de culture de croissance pour obtenir une concentration de 90 cryptes/μL.
- Ajouter 2 volumes de BMM non dilué pour obtenir une concentration finale de 30 cryptes/μL. Pipeter soigneusement de haut en bas sans introduire de bulles d’air dans le mélange.
note: Gardez toujours le tube sur de la glace pour éviter la solidification du BMM.
- Plaque 10 μL de cryptes/BMM mélangées dans chaque puits. Pour l’analyse par cytométrie en flux, utilisez des plaques à fond rond de 96 puits. Répartissez 10 μL au centre de chaque puits sous la forme d’un dôme.
note: Plaquez les organoïdes sous la forme d’une couche mince pour le test d’imagerie afin de permettre leur imagerie en profondeur.
- Laissez la plaque pendant 5 min à RT pour permettre au BMM de se solidifier. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 15 min.
- Ajouter 250 μL de milieu de croissance dans chaque puits en prenant soin de ne pas détacher le BMM.
- Placez les plaques dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
- Effectuez l’analyse des ROS entre les jours 4 et 6 de la culture. Sinon, changez de milieu et divisez les organoïdes après l'apparition de plusieurs longues structures bourgeonnantes et lorsque les cellules mortes s'accumulent dans les lumières des organoïdes.
3. Passage des organoïdes
- Commencez à passer les organoïdes de l’intestin grêle à partir du 6ème jour de culture, lorsque des structures bourgeonnantes importantes se sont formées et que les lumières des organoïdes sont devenues sombres.
note: La lumière de l'organoïde devient sombre en raison de l'accumulation de cellules mortes, de débris et de mucus. Évitez de laisser les organoïdes pousser avant de les fendre. Le taux de fendillement dépend de la croissance des organoïdes. Il est recommandé de passer les organoïdes avec un rapport de 1:2 au jour 6 et de 1:3 au jour 10.
- Remplissez un tube de 15 ml avec 4 ml de DMEM/F-12 avancé froid et conservez-le sur de la glace.
note: Ici, les volumes pour une plaque de culture à 96 puits sont fournis. Si un format différent est utilisé, ajustez le volume en conséquence.
- Aspirez soigneusement le fluide à l’aide d’une pipette ou d’une pompe à vide à partir des puits sans toucher les dômes BMM, et jetez-le.
- Ajouter 100 μL de DMEM/F-12 avancé froid par puits. Pipeter de haut en bas pour briser le BMM et transférer le contenu du puits dans le tube de 15 ml.
- Lavez le puits avec 200 μL de DMEM avancé / F-12 froid et recueillez-le dans le même tube.
note: Si vous passez plusieurs puits dans les mêmes conditions expérimentales, le contenu des puits peut être regroupé dans le même tube collecteur de 15 ml.
- Faites tourner le tube collecteur de 15 mL à 100 x g pendant 5 min à 4°C.
- Jetez le surnageant et ajoutez 1 ml de DMEM/F-12 avancé froid à la pastille. À l’aide d’une pointe P1000, prenez une pointe P10 (sans filtre) et pipetez de haut en bas au moins 20 fois.
- Ajouter 4 ml de DMEM/F-12 avancé froid dans le tube. Essorage à 300 x g pendant 5 min à 4°C.
- Aspirez le surnageant à l’aide d’une pipette ou d’une pompe à vide sans déranger la pastille. Ensuite, perturbez mécaniquement le plomb
.
- Ajouter le BMM dilué dans un milieu de culture (rapport 2:1). Pipetez soigneusement de haut en bas sans introduire de bulles d’air dans le mélange.
- Plaque 10 μL de cryptes/BMM mélangées dans chaque puits.
- Maintenez la plaque pendant 5 min à RT pour permettre au BMM de se solidifier. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 15 min.
- Ajouter 250 μL de milieu de culture dans chaque puits.
note: Attention à ne pas détacher le BMM.
- Placez les plaques dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
4. Préparation de réactifs et de matériaux pour évaluer le stress oxydatif dans les organoïdes intestinaux
- Préparez une solution mère de 250 mM d’inhibiteur de la N-acétylcystéine (NAC) (voir le tableau des matières) et mettez à nouveau en suspension 10 mg avec 245 μL de DPBS. Utilisation à une concentration finale de 1 mM.
- Préparer une solution mère de 50 mM d’hydroperoxyde de tert-butyle inducteur (tBHP), à 70 % dans de l’eau, et diluer 3,22 μL avec 496,8 μL de DPBS. Utilisation à une concentration finale de 200 μM.
- Pour l’étude de cytométrie en flux, préparer une solution de travail de 250 μM d’une sonde fluorogénique (voir le tableau des matériaux) en diluant la solution mère 1/10 dans du DMSO. Utilisation à une concentration finale de 1 μM.
note: Comme indiqué dans les instructions du fabricant, la sonde fluorogène est sensible à la lumière et à l'oxygène. Les stocks et les aliquotes ne doivent pas être ouverts et fermés trop de fois.
- Préparer une solution finale de 0,1 μg/mL de DAPI dans le DPBS, à utiliser pour la discrimination des cellules mortes dans le test de cytométrie en flux.
note: Ces étapes décrivent l’utilisation de témoins négatifs et positifs qui doivent être inclus dans tout dosage, en utilisant les conditions indiquées à la figure 2A. Le test peut être utilisé pour tester des composés anti-oxydants ou pro-oxydants. Les étapes sont les mêmes, et la seule différence est lorsque les composés sont ajoutés avant d’utiliser le colorant fluorogène.
5. Quantification du stress oxydatif sur les organoïdes dissociés à l’aide d’un cytomètre en flux
- Ajouter 1 μL de solution mère de NAC dans les puits pour les témoins négatifs afin d’obtenir une concentration finale de 1 mM.
note: Utilisez les organoïdes plaqués dans les plaques à fond rond de 96 puits.
- Incuber pendant 1 h à 37 °C et 5 % CO2.
- Ajouter 1 μL de solution mère de BHP dans les puits correspondants pour obtenir une concentration finale de 200 μM.
- Incuber pendant 30 min à 37 °C et 5 % de CO2.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, retirez le fluide sans déranger le BMM attaché et transférez-le sur une autre plaque inférieure ronde à 96 puits. Gardez cette assiette de côté.
- Ajoutez 100 μL de trypsine et, à l’aide d’une pipette multicanaux, pipetez de haut en bas au moins cinq fois pour détruire le BMM.
- Incuber pendant 5 min maximum à 37 °C et 5 % de CO2.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, pipetez de haut en bas au moins cinq fois pour dissocier les organoïdes.
- Essorage à 300 x g pendant 5 min à RT.
- Jetez le surnageant en inversant la plaque. Remettez le milieu collecté à l’étape 6.3 dans les puits correspondants et remettez les cellules en suspension en pipetant 5 fois de haut en bas.
- Ajouter la sonde fluorogénique à la concentration finale de 1 μM. Ajouter 1 μL par puits à partir de la dilution de 250 μM et incuber pendant 30 min à 37 °C et 5 % de CO2,
note: N'ajoutez pas la sonde fluorogène aux puits nécessaires aux réglages de l'instrument (Figure 2B).
- Essorage à 300 x g pendant 5 min à RT.
- Remettre les cellules en suspension avec 250 μL de solution DAPI à 0,1 μg/mL. Transférez les échantillons dans les tubes de cytométrie en flux appropriés, maintenez les tubes sur de la glace et procédez à l’analyse.
note: Ajoutez du PBS au lieu du DAPI aux puits nécessaires aux réglages de l'instrument (Figure 2B).
- Optimisez les paramètres de tension de diffusion avant et latérale sur la commande non colorée et les tensions laser pour chaque fluorophore à l’aide d’échantillons mono-colorés.
- À l’aide d’une stratégie de contrôle appropriée (Figure 3A), collectez un minimum de 20 000 événements.
REMARQUE : 50 000 événements sont préférables. Les paramètres d’acquisition détaillés varient en fonction de l’instrument utilisé.
