Dosage par cytométrie en flux pour quantifier le stress oxydatif : un dosage pour quantifier les espèces réactives de l’oxygène dans les organoïdes intestinaux à l’aide de sondes fluorogènes

Résumé

Source : Stedman, A., et al., Analyse du stress oxydatif dans les organoïdes intestinaux murins à l’aide d’une sonde fluorogénique sensible aux espèces réactives en oxygène.J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo présente un test de cytométrie en flux permettant de quantifier les niveaux de ROS dans des organoïdes intestinaux 3D obtenus à partir de souris transgéniques exprimant la GFP. Cette méthode fournit un modèle expérimental in vitro pour étudier l’efficacité des composés testés sur la production de ROS.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de réactifs et de matériaux pour la culture d’organoïdes intestinaux

1. Pour préparer le milieu de culture de croissance, mélanger du DMEM/F-12 avancé complété par 1 solution de glutamine, 1 solution de pénicilline et de streptomycine (P/S), 10 mM d’HEPES, 50 ng/mL d’EGF murin, 20 μg/mL de Noggin murin, 500 ng/mL de R-Spondin1 de souris (voir le tableau des matières). Laisser le milieu à température ambiante (RT) pendant l'extracti....

Résultats

Figure 1 : Images représentatives de cryptes et d’organoïdes.(A) Exemple de fraction F1 obtenue après la première incubation avec de l’EDTA, enrichie en villosités (carrées), avec quelques débris (étoile) et cryptes (cercle). (B) Exemple de fraction F4 enrichie dans des cryptes. (C) Suspension ne présentant que des cryptes isolées obtenues apr.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
souris
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)	Le Laboratoire Jackson
Milieu de culture de croissance
DMEM avancé F12 (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
Supplément de B-27, moins vitamine A	ThermoFisher	12587010	Concentration des actions : 50x
GlutaMAX (glutamine)	ThermoFisher	35050038	Concentration du stock : 100x
Hepes	ThermoFisher	15630056	Concentration du stock : 1 m
EGF murin	R&D	2028-EG-200	Concentration de la pâte : 500 μg/mL dans le PBS
murine Noggin	R&D	1967-NG/CF	Concentration de la matière : 100 μg/mL dans le PBS
Spondine R murine1	R&D	Référence 3474-RS-050	Concentration de la pâte : 50 μg/mL dans du PBS
N-2 Supplément	ThermoFisher	17502048	Concentration du stock : 100x
Pénicilline-streptomycine (P/S)	ThermoFisher	15140122	Concentration de la matrice : 100x (10 000 unités/mL de pénicilline et 10 000 μg/mL de streptomycine)
matériel
Crépine à cellules de 70 μm	Corning	Référence 352350
Fond rond à 96 puits	Corning	Référence 3799
Ciseaux à pointe sphérique	Outils de Fine Science GMBH	Référence 14086-09
Réactif CellROX® Deep Red	ThermoFisher	Réf. C10422
DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (sonde fluorée)	ThermoFisher	D1306	bouillon à 10 mg/mL
DPBS 1x sans calcium ni magnésium (DPBS)	ThermoFisher	14190144
Facteur de croissance du matrigel réduit, sans rouge de phénol (matrice de membrane basale)	Corning	356231	une fois reçu, décongeler O/n au réfrigérateur, conserver 1h sur de la glace et, faire 500 mL d’aliquotes et conserver à -20 °C
N-acétylcystéine (NAC)	sigma	A9165
solution d’hydroperoxyde de tert-butyle (tBCHP) (70 % en poids. En H2O2)	sigma	458139
Enzyme TrypLE Express (1X), sans rouge de phénol (trypsine)	ThermoFisher	12604013
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	ThermoFisher	15575020
Y-27632	sigma	N° Y0503	Inhibiteur de roche à utiliser pour minimiser la mort cellulaire lors de la dissociation tissulaire
Programmes et équipement
Attune NxT (cytomètre en flux)	ThermoFischer		Analyseur de cytomètre en flux
FlowJo	BD Biosciences		Analyse FACS
prisme	Logiciel GraphPad		analyse statistique