1. Préparation des constructions d’expression de baculovirus
- Purifier la ligase SUMO E3 K-bZIP en clonant l’ADNc de K-bZIP dans un vecteur de baculovirus à double expression (voir le tableau des matériaux) avec une étiquette d’épitope N-terminal. Nous avons réussi à utiliser une balise octapeptide (indiquée tout au long du protocole comme vector-tag-K-bZIP).
note: Le modèle d’ADN pour le clonage par réaction en chaîne par polymérase (PCR) K-bZIP est un reverse DNA transcrit à partir d’ARN isolé à partir de cellules TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 après un traitement à la doxycycline.
- Transférez l’ADNc K-bZIP complet dans le vecteur d’expression double avec des sites de clonage CpoI. CpoI digère le produit de PCR et 1 μg du vecteur d’expression double à 37 °C pendant 3 h.
- Séparer et extraire l’ADN digéré après électrophorèse sur un gel d’agarose à 0,8 %. Lister l'insert (K-bZIP) et le vecteur par l'ADN ligase T4 à 16 °C pendant 30 min selon les instructions du fabricant (voir tableau des matériaux).
- Ajouter 5 μL d’ADN ligaturé à 50 μL de cellules E. coli compétentes « A » (voir le tableau des matériaux) dans un tube de 1,5 mL. Mettre sur glace pendant 30 min. Ensuite, incubez le tube de 1,5 mL dans un bain-marie à 42 °C pendant 45 s et placez immédiatement le tube sur de la glace pendant 3 min.
- Ajouter 600 μL DE MILIEU S.O.C. (0,5 % (p/v) d’extrait de levure, 2 % (p/v) de tryptone, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 20 mM de MgSO4 et 4 % (p/v) de glucose) dans le tube et incuber à 37 °C pendant 1 h. Ensuite, centrifugez le tube à température ambiante pendant 3 min à 600 x g.
- Retirer le surnageant, remettre en suspension la pastille avec 60 μL de milieu Luria-Bertani (LB ; 1 % (p/v) de tryptone, 0,5 % (p/v) d’extrait de levure et 85 mM de NaCl) et étaler sur des plaques de gélose LB contenant 100 μg/mL d’ampicilline. Incuber la plaque de gélose à 37 °C pendant 16 h.
- Sélectionner 1 colonie à inoculer dans un milieu de 5 mL LB contenant 100 μg/mL d’ampicilline et cultiver à 37 °C pendant 16 h en agitant à 250 tr/min. Ensuite, extrayez le plasmide, vector-tag-K-bZIP, à l'aide d'un kit d'extraction de plasmide selon les instructions du fabricant (voir Tableau des matériaux).
- Générer le bacmid recombinant hébergeant l’étiquette-K-bZIP par la transformation de l’étiquette-vecteur-K-bZIP en cellules E. coli compétentes « B » (voir Tableau des matériaux).
- Mélanger 0,2 μg de plasmide vector-tag-K-bZIP et 100 μL de E. coli dans un tube de 1,5 mL et mis sur de la glace pendant 30 min. Incuber le tube dans un bain-marie à 42 °C pendant 45 s et mettre immédiatement le tube sur de la glace pendant 3 min.
- Ajouter 900 μL de milieu S.O.C. dans le tube et incuber à 37 °C pendant 4 h avec rotation à 50 tr/min. Ensuite, prélever 10 μL de milieu et ajouter 50 μL supplémentaires de milieu S.O.C à étaler sur des plaques de gélose LB contenant 50 μg/mL de kanamycine, 7 μg/mL de gentamicine, 10 μg/mL de tétracycline, 100 μg/mL de substrat de galactosidase et 40 μg/mL d’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), et incuber les plaques pendant 48 h à 37 °C.
- Inoculer une colonie blanche dans un milieu de 5 mL LB contenant 50 μg/mL de kanamycine, 7 μg/mL de gentamicine et 10 μg/mL de tétracycline. Incuber à 37 °C en secouant 250 tr/min pendant 16 h.
- Isolez l’ADN bacmid recombinant hébergeant le marqueur K-bZIP, quantifiez et remettez en suspension à une concentration de 1 μg/μL.
- Générer des baculovirus recombinants exprimant le tag-K-bZIP en transfectant 1 μg d’ADN bacmid recombinant contenant le tag-K-bZIP dans des cellules Sf9 dans un puits d’une plaque à 6 puits.
- Semez 2 x 10cellules 6 Sf9 (voir le tableau des matières) dans un milieu d'insectes Grace de 2 mL rempli de 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et de 1 % de gentamicine dans chaque puits d'une plaque à 6 puits, puis incubez à 27 °C pendant 1 h.
- Maintenir une culture en phase logarithmique de cellules Sf9 dans le milieu d'insectes de Grace fourni avec 10 % de FBS, 1 % de gentamicine et 1 % de détergent C (voir le tableau des matériaux) à 27 °C en suspension orbitale à 140 tr/min. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’une coloration au bleu trypan ; La viabilité cellulaire doit dépasser 95 %. Maintenir les cellules en utilisant un rapport de sous-culture de 1:3 tous les 2-3 jours (densité minimale ~0,5 x 10,6 cellules/mL).
- Ajouter 2 μL d’ADN bacmid (1 μg/μL) et 98 μL de milieu sérique réduit (voir le tableau des matériaux) dans un tube de 2 mL. Ensuite, ajoutez 4 μL de réactif de transfection (voir Tableau des matériaux) dans le tube et mélangez bien. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Ajouter ce mélange de transfection (104 μL) dans chaque puits et incuber à 27 °C pendant 12 à 16 h.
- Retirer le milieu épuisé par aspiration douce et le remplacer par 2 ml de milieu d'insecte Grace's frais contenant 10 % de FBS et 1 % de gentamicine. Les cellules Sf9 adhèrent librement à la surface de la plaque et ne seront pas perturbées par une aspiration douce.
- Prélever le baculovirus recombinant après la transfection et amplifier le baculovirus pour obtenir des stocks à titre élevé (P1) pour d’autres expériences.
- 72 h après le changement de milieu, gratter les cellules Sf9 à l’aide d’un extracteur de cellules stériles, recueillir le surnageant de chaque puits individuel dans un tube de 1,5 mL et agiter pendant 10 s.
- Centrifuger à 4 °C pendant 3 min à 150 x g. Prélever le surnageant sous forme de baculovirus P0 et d’aliquote dans des tubes de 1,5 mL (1 mL de baculovirus dans chaque tube). Conserver à -80 °C.
- Grainez 1 x 107 cellules Sf9 dans 10 mL de milieu pour insectes Grace's fourni avec 10 % de FBS et 1 % de gentamicine dans une boîte de Pétri de 10 cm et incubez à 27 °C pendant 1 h.
- Pour l’amplification de baculovirus recombinants exprimant le marqueur K-bZIP, ajouter 0,5 mL de baculovirus P0 aux cellules Sf9 ensemencées et incuber à 27 °C pendant 48 h.
- Prélever le surnageant sous forme de baculovirus P1 dans un tube de 15 mL et le conserver à 4 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à 1 mois.
2. Purification du K-bZIP
- Maintenir une culture en phase logarithmique de cellules Sf9 dans le milieu d'insectes de Grace alimenté avec 10 % de FBS, 1 % de gentamicine et 1 % de détergent C à 27 °C en suspension orbitale à 140 tr/min, comme décrit à l'étape 1.3.2.
- Le jour de la transduction, ajouter 1 mL de surnageant contenant un baculovirus (P1) dans 250 mL de cellules Sf9 d’une densité de 2 x 106 cellules/mL.
- Incuber les cellules Sf9 pendant 72 h à 27 °C sur un agitateur orbital avec agitation à 140 tr/min, puis recueillir par centrifugation à 2 740 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Retirer les pastilles de surnageant et de cellules de lyse dans un tampon de lyse de 10 mL (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M NaCl, 1 % de détergent A (voir le tableau des matières), 2 % de glycérol, cocktail d’inhibiteurs de protéase) et tourner à 50 tr/min à l’aide d’un mélangeur en suspension à 4 °C pendant 30 min.
- Centrifuger le lysat cellulaire à 15 000 x g pendant 15 min pour recueillir le surnageant.
- Pour purifier le tag-K-bZIP, incubez les lysats cellulaires (10 mL) avec 50 μL de billes magnétiques marquées par des anticorps dans des tubes en polypropylène de 14 mL, et faites pivoter à 50 tr/min pendant 3 h à 4 °C à l’aide d’un mélangeur en suspension. Après la capture des protéines, granuler les billes à 800 x g de centrifugation pendant 30 s à 4 °C. Retirer la majeure partie du surnageant, remettre les billes en suspension dans le volume résiduel d’environ 1 mL et les transférer dans un tube de 1,5 mL pour le lavage.
- Lavez la protéine capturée en plaçant le tube contenant les billes sur un support magnétique, et retirez le surnageant une fois que les billes magnétiques ont complètement adhéré au côté du tube.
- Lavez les perles avec un tampon de lyse quatre fois.
- Ajoutez 1 mL de tampon de lyse dans des tubes de 1,5 mL et retournez les tubes 10 fois. Placez le tube de 1,5 ml sur un support magnétique et retirez le surnageant comme décrit en 2.7.
- Répétez l’étape précédente encore 3 fois.
- Lavez les perles avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) une fois.
- Ajoutez 1 mL de PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8 mM de Na2HPO4, 1,5 mM de KH2PO4) dans des tubes de 1,5 mL et retournez les tubes 10 fois.
- Placez le tube de 1,5 ml sur un support magnétique, puis retirez le surnageant.
- Eluter la protéine K-bZIP des billes magnétiques marquées par anticorps en ajoutant 100 μL d’octapeptide de 150 μg/mL dilué dans du PBS dans un tube de 1,5 mL. Faites tourner le tube pendant 10 min à 50 tr/min à l’aide d’un mélangeur à suspension à température ambiante. Ensuite, replacez le tube sur le support magnétique et récupérez le surnageant contenant K-bZIP dans un tube propre de 1,5 ml.
- Analyser 1-5 μL de protéine tag-K-bZIP purifiée par SDS-PAGE suivie d’une coloration au bleu de Coomassie. Chargez des échantillons de 2 g, 1 g et 0,5 g d’albumine sérique bovine (BSA) sur le même gel et utilisez-le pour la quantification avec un programme de traitement d’image, comme ImageJ. Estimez la concentration de K-bZIP par rapport aux normes BSA.
- Le K-bZIP purifié est maintenant prêt à être utilisé dans chaque test de SUMOylation. Diluer le K-bZIP dans du PBS jusqu’à une concentration finale de 100 ng/μL et le stocker dans de petites aliquotes à -80 °C.
3. Dosage de SUMOylation
- Ajouter 3 μL de 100 ng/μL de tag-K-bZIP purifié dans le mélange maître de chaque réaction de SUMOylation in vitro. Les composants du mélange maître contiennent 1 μL de tampon protéique, 1x tampon SUMOylation, 0,5 μL de protéine p53 (0,5 mg/mL), 25 nM d’enzyme activatrice E1 (concentration mère : 1 μM), 50 nM d’enzyme conjugaison E2 (concentration mère : 10 μM) et 250 nM chacun des peptides SUMO (SUMO-1, SUMO-2 ou SUMO-3 ; concentration mère : 5 μM) jusqu’à un volume final de 17 μL.
- Mélangez délicatement le contenu et incubez la réaction à 30 °C pendant 3 h. Arrêtez la réaction en ajoutant 20 μL de 2x tampon de chargement SDS-PAGE (100 mM Tris-HCL pH 6,8, 4 % de dodécylsulfate de sodium, 0,2 % (p/v) de bleu de bromophénol, 20 % (v/v) de glycérol et 200 mM de β-mercaptoéthanol) et dénaturez les échantillons à 95 °C pendant 5 min.
- Séparez les échantillons sur SDS-PAGE, transférez les protéines séparées sur une membrane PVDF à l’aide d’un appareil de transfert électrophorétique semi-sec, et analysez-les par Western blot à l’aide d’un anticorps anti-p53.
- Installez l’appareil à gel et chargez 20 μL d’échantillon dans des puits de gel.
- Faites fonctionner le gel à 10 % dans un courant constant à 80 V pendant environ 120 min (jusqu’à ce que la bande de colorant atteigne le bas du gel). Une fois l’électrophorèse terminée, coupez l’alimentation électrique.
- Débranchez l’appareil de gel et les cassettes de gel pour retirer le gel et faites flotter le gel dans un tampon de transfert semi-sec (48 mM de Tris-HCl, 39 mM de glycine, 20 % de méthanol) pendant 5 min.
- Prenez un autre récipient et trempez la membrane PVDF dans du méthanol pendant 1 min. Ensuite, retirez le PVDF du méthanol et mettez-le dans un tampon de transfert semi-sec. Agitez doucement la membrane pendant 5 min.
- Retirez le couvercle de sécurité de l’appareil électrophorétique semi-sec.
- Pré-mouillez le papier filtre et préparez un sandwich de gel sur l’anode inférieure en platine comme suit : papier filtre, membrane PVDF, gel et papier filtre.
- Fixez la plaque cathodique et le couvercle de sécurité, puis faites fonctionner le transfert à courant constant de 15 V pendant 90 min. Coupez l’alimentation électrique, débranchez l’appareil semi-sec et retirez la membrane PVDF.
- Membrane PVDF bloc avec tampon bloquant (5 % de lait écrémé dans un tampon TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1 % de détergent B (voir tableau des matériaux), pH 7,6)) à température ambiante pendant 1 h avec agitation à 30 tr/min par agitateur orbital.
- Hybrider la membrane PVDF avec l’anticorps anti-p53 dilué (1:1 000) dans un tampon de blocage pendant 12 à 16 h à 4 °C avec agitation à 30 tr/min à l’aide d’un mélangeur en suspension.
- Sortez la membrane PVDF dans un récipient et mettez-la dans le TBST. Rincez deux fois de plus la membrane PVDF avec du TBST.
- Tremper la membrane PVDF dans du TBST pendant 30 min avec agitation à 45 tr/min par agitateur orbital.
- Hybrider la membrane PVDF avec un anticorps anti-lapin conjugué à de la peroxydase de raifort (HRP) diluée (1:4 000) dans un tampon bloquant pendant 1 h à température ambiante avec 30 tr/min en agitant à l’aide d’un mélangeur à suspension.
- Lavez la membrane PVDF avec du TBST 3 fois comme décrit à l’étape 3.4.10.
- Faire tremper la membrane PVDF dans du TBST pendant 30 min en secouant 45 tr/min à l’aide d’un mélangeur à suspension. Retirez le TBST et ajoutez du PBS pour préserver la membrane PVDF à 4 °C jusqu’à 12 h.
- Mélangez le substrat chimiluminescent amélioré (substrat ECL) réactifs 1 et 2 (1:1) (voir le tableau des matériaux). Retirez la membrane PVDF du PBS, épongez brièvement avec une serviette en papier ou un essuie-glace léger pour absorber l’excès d’humidité, et ajoutez immédiatement 400 μL de réactif ECL à la surface de chaque membrane pendant 3 à 5 min. Éliminez l’excès de réactif ECL en épongeant brièvement, mais ne laissez pas la membrane sécher complètement.
- Exposez la tache à l’aide d’un système d’imagerie par luminescence ou d’un film d’autoradiographie.
