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1. Préparation du réactif
- Préparez un milieu DMEM à faible fluorescence pour les tests à l’aide d’un lecteur de fluorescence de microplaques. Mélanger 25 mM de glucose, 0,4 mM de glycine, 0,4 mM d’arginine, 0,2 mM de cystéine, 4,0 mM de glutamine, 0,2 mM d’histidine, 0,8 mM d’isoleucine, 0,8 mM de leucine, 0,8 mM de lysine, 0,2 mM de méthionine, 0,4 mM de phénylalanine, 0,4 mM de sérine, 0,8 mM de thréonine, 0,078 mM de tryptophane, 0,4 mM de tyrosine, 0,8 mM de valine, 1,8 mM de CaCl2, 0,81 mM de MgSO4, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCO3, 110 mM NaCl, 0,9 mM NaH2PO4. Ajustez le pH de la solution à l’aide de HCl ou de NaOH à pH 7,4. Stérilisez le milieu par filtration.
note: Ce milieu contient des composants du milieu DMEM standard à haute teneur en glucose, à l’exception du Fe(NO3)3, des vitamines et du rouge de phénol qui sont omis. Le rouge de phénol, la riboflavine et le pyridoxal dans le milieu de culture DMEM ordinaire interfèrent considérablement avec la détection du signal de fluorescence. Le milieu de culture sans ces composants est crucial pour une imagerie GFP réussie de cellules vivantes. Le milieu est stable pendant 12 mois lorsqu’il est stocké au réfrigérateur.
2. Dosage de la dégradation en temps réel de la NLS-luciférase-GFP à l’aide d’un lecteur de microplaques à fluorescence
- Ensemencez environ 1 x 10 cellules4 HeLa dans des plaques de culture tissulaire noires à 96 puits à fond transparent. Après la culture O/N, une confluence de 50 à 70 % est atteinte au moment de la transfection.
REMARQUE : 60 μl de milieu contenant des cellules HeLa complètement en suspension sont ensemencés directement dans chaque puits. N’ajoutez pas de milieu supplémentaire ou de plaque de roche d’avant en arrière après l’ensemencement, sinon les cellules pourraient être réparties de manière inégale.
- Transfectez des cellules HeLa avec 0,05 à 0,1 μg de plasmide NLS-luciférase-GFP/pRK5 dans chaque puits à l'aide d'un réactif de transfection conformément aux instructions du fabricant. Préparez un mélange de transfection maître contenant de l’ADN et du réactif de transfection et aliquotez-le pour chaque puits. Trois puits contenant des cellules ne sont pas transfectés avec de l’ADN, qui sert de contrôle pour le signal de fluorescence de fond pour chaque condition de traitement.
note: Une autre façon de réduire la variation de transfection consiste à transfecter les cellules avant l’ensemencement. Cependant, une grande partie des cellules transfectées avec des protéines mal repliées ne parviennent pas à se fixer ou montrent une viabilité réduite en utilisant cette méthode. Il est probable que certaines cellules ne supportent pas le stress causé par la digestion de la trypsine lors de l’expression de protéines toxiques mal repliées. En conséquence, le signal fluorescent global est considérablement réduit.
- 20 à 24 heures après la transfection, examiner les cellules vivantes au microscope à fluorescence inversée pour détecter l’expression de la GFP avec une longueur d’onde d’excitation de 450 à 490 nm.
- Retirer le milieu par aspiration intra-utérine. Ajoutez environ 200 μl de 1x PBS dans chaque puits, puis aspirez-le pour éliminer la quantité résiduelle de milieu DMEM.
- Ajouter 60 μl de milieu DMEM à faible fluorescence avec 5 % de FBS et 50 μg/ml de CHX. Pour examiner la dégradation du protéasome, inclure un inhibiteur de protéasome MG132 (10 μM) supplémentaire dans un ensemble d’échantillons. Réglez le triple des puits pour chaque traitement/condition.
note: Le traitement MG132 est inclus comme contrôle de la dégradation protéasomale car il est crucial d’exclure d’autres facteurs pouvant provoquer une chute du signal de fluorescence, y compris la mort cellulaire et l’extinction de la fluorescence.
- Mesurez immédiatement le signal de fluorescence de la GFP sur un lecteur de plaques fluorescentes après avoir ajouté CHX.
note: Les paramètres de mesure du logiciel sont indiqués dans le Tableau 1.
- Lisez la plaque toutes les heures pendant 8 à 10 heures. Après lecture, remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire.
- Exportez les données sous forme de tableur. Utilisez la valeur moyenne de plusieurs lectures pour chaque puits ainsi que l’intensité de fluorescence. Normalisez les valeurs de chaque point de données sur les valeurs moyennes de Temps 0 dans les groupes respectifs. Tracez l’intensité de fluorescence normalisée au fil du temps, comme illustré aux figures 1A et 1B, ainsi qu’à la figure 2, panneaux de droite.
- Effectuer une analyse statistique des taux de dégradation entre deux conditions à l’aide de l’ANOVA à deux facteurs avec mesures répétées.
note: Dans cette analyse, « l’intensité de fluorescence » est la variable dépendante tandis que les « conditions de traitement » et le « temps » sont les deux facteurs. Au lieu de comparer les données à des points temporels individuels, l’ANOVA à deux facteurs avec mesures répétées analyse la différence entre les deux groupes de traitement sur l’ensemble du parcours.
Tableau 1 : Paramètres de mesure sur lecteur de microplaques à fluorescence.
| Fichier de définition de plaque | GRE96fb |
| Mode de mesure | Intensité de fluorescence Fond |
| Longueur d’onde | Longueur d’onde d’excitation | 485 milles marins |
| Bande passante d’excitation | 9 milles marins |
| Longueur d’onde d’émission | 535 milles marins |
| Largeur de bande d’émission | 20 milles marins |
| Nombre de clignotements | 5 |
| Gain | Mode d’emploi 200 |
| Temps d’intégration | 20 μs |
| Plusieurs lectures par puits | type | Cercle (rempli) |
| taille | 5×5 |
| frontière | 400 μm |
