Bioreporter Assay : une technique sensible utilisant un système de rapporteur bioluminescent pour détecter les anticorps du SARS-CoV-2

Résumé

Source : Rezaei, R. et al., Détection de l’anticorps à domaine de liaison au récepteur du SARS-CoV-2 à l’aide d’un biorapporteur basé sur HiBiT. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous montrons le test basé sur le système biorapporteur HiBit-RBD pour détecter les anticorps neutralisants du SARS-CoV-2. Ce système cible le domaine RBD viral en utilisant un système rapporteur bioluminescent contenant HiBiT fusionné au domaine RBD.

Protocole

1. Détection des anticorps anti-RBD à l’aide d’un test rapide et sensible

1. Test de détection des anticorps HiBiT-RBD
   1. Préparer le bioreporter HiBiT-RBD.
      note: Il est recommandé d’utiliser le surnageant pour le dosage suivant, car il est plus simple à collecter et contient la version glycosylée mature de la protéine. De plus, le lysat possède plusieurs autres protéines qui pourraient interférer avec l’interaction HiBiT-RBD-anticorps.
   2. Combinez 50 μL du surnageant contenant HiBiT-RBD avec 1 μg de l’anticorps commercial SARS-CoV-2-RBD dans un microtube de 1,5 mL. Ajouter 20 μL de protéine de liaison aux immunoglobulines (protéine G) à la solution. Augmentez le volume total à 300 μL en ajoutant PBS.
      note: Le volume total du mélange peut être réduit à 150 μL. Des volumes totaux inférieurs ne sont pas recommandés, car cela pourrait entraîner un mélange inadéquat des anticorps avec le biorapporteur.
   3. Incuber le(s) tube(s) sur un agitateur de tube ou un rotateur pendant 30 min. Centrifuger à 12 000 x g pendant 30 s, jeter le surnageant et laver avec du PBS. Répétez le processus trois fois pour retirer le HiBiT-RBD libre. Remettre en suspension dans 50 μL de PBS et transférer sur une plaque à 96 puits.
   4. Ajouter 50 μL de 1x LgBiT et attendre 5 min. Ajoutez ensuite 50 μL de substrat 1x NanoLuc. Lisez immédiatement le signal luminescent à l’aide d’un luminomètre.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Rondelle magnétique portable Bio-Plex	Bio-Rad	171020100	appareil
Système de dosage de la luciférase Dual-Glo	Promega	E2940	Trousse de 100 mL
LgBiT	Promega	N° N3030	Kit de dosage
Perles magnétiques Pierce Protein G	Thermo Fisher Scientific	Référence 88848	Test
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Anticorps neutralisant de pointe, Mab de souris	SinoBiologique	40592-MM57	Test
Lecteur de microplaques Synergy MX	BioTek		Luminomètre à lecteur de plaques à 96 puits