Dosage cellulaire des anticorps neutralisants AAV : une technique colorimétrique pour détecter les anticorps neutralisants contre des virus adéno-associés spécifiques dans le sérum

Résumé

Source : Bass-Stringer, S., et al. Une méthode étape par étape pour détecter les anticorps neutralisants contre l’AAV à l’aide d’un test colorimétrique basé sur des cellules. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test colorimétrique in vitro pour détecter la présence d’anticorps neutralisants contre les vecteurs du virus adéno-associé recombinant de sérotype 6 exprimant la phosphatase alcaline (rAAV6) dans des échantillons de sérum de mouton. Le test utilise la réaction entre l’AAV codant pour un gène de phosphatase alcaline placentaire humaine et son substrat pour générer un produit violet insoluble.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

Une vue d’ensemble schématique du protocole de test est fournie à la figure 1.

1. Préparation initiale

1. Pour l’évaluation chez les moutons : prélever du sang dans des tubes activateurs de caillots de séparation de sérum de 8 mL (voir le tableau des matières), laisser l’échantillon de sang à température ambiante (RT) pendant 20 à 30 min, puis faire tourner à 2 100 x g pendant 15 min. Le surnageant clair qui se forme au sommet des tubes est le sérum. Aliquote de la phase aqueuse claire dans des tubes de microcentrifugation et stockage à -80 °C.
   note: Le sérum à -80 °C reste stable pendant ~5 ans. Le sang a été prélevé dans la veine carotide à l’aide d’une aiguille de 16 G (tronçon de pointe) et d’une seringue provenant d’animaux conscients.
2. Chauffez le sérum fœtal bovin inactivé (FBS) en le plaçant dans un bain-marie à 56 °C pendant 30 min, et remuez par intermittence. Pour plus de précision, placez un thermomètre dans une deuxième bouteille contenant un volume équivalent d’eau et ajoutez-le dans le bain de chaleur en même temps que la bouteille FBS. Commencez le chronométrage lorsque le thermomètre atteint 56 °C.
3. Utiliser une technique d’asepsie et une pratique de culture cellulaire appropriées pour toutes les étapes ultérieures effectuées dans la hotte de culture cellulaire. Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur tous les objets et sur la hotte avant utilisation et nettoyez-les avec de l’hypochlorite de sodium à 1 % une fois terminé.
4. Préparez un milieu Eagle modifié (DMEM) complet de Dulbecco en combinant du DMEM à haute teneur en glucose (4,5 g/L) (89 %) avec du FBS inactivé à la chaleur (10 %) et de la pénicilline streptomycine (1 %). Combiner et filtrer à l’aide d’un système de filtration sous vide stérile (pores de 0,22 μm, membrane en polyéthersulfone) (voir le tableau des matériaux). Conservez le DMEM complet emballé dans une feuille d’aluminium à 4 °C.
5. Etablir les cellules HT1080 (voir Tableau des Matériaux) et le passage dans une fiole carrée de^{75 cm 2}. Créez plusieurs stocks de cellules gelées. N’utilisez pas de cellules après 20 passages, car d’autres passages pourraient influencer les résultats du dosage.

2. Jour 1 - Placage des cellules

1. Passage des cellules HT1080 lorsqu’elles atteignent ~80 % de confluence.
2. Préchauffer du DMEM complet (préparé à l’étape 1.4), de la trypsine-EDTA à 0,05 % et 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 °C dans un bain-marie. Retirez le milieu de croissance des cellules acheminées à l’aide d’un système d’aspiration.
   note: Toutes les aspirations de ce protocole utilisent un système de vide avec un tube fixé à une pipette sérologique stérile de 5 mL.
3. Lavez les cellules dans 10 ml de PBS 1x préchauffé (37 °C) et trypsinisez les cellules pendant 3 à 4 minutes dans 4 ml de trypsine-EDTA préchauffée à 0,05 % pour détacher les cellules du ballon.
4. Inactivez la trypsine en ajoutant 6 mL de DMEM complet préchauffé et pipetez les cellules dans un tube de 50 mL. Calculer le nombre et la concentration de cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et de la méthode d’exclusion du bleu de trypan.
5. Diluez les cellules à une concentration de 1 x 10⁵ cellules/mL dans du DMEM complet préchauffé. Semez 100 μL de cellules/puits dans des plaques claires à fond plat de 96 puits (1 x 10⁴ cellules par puits). Incuber la plaque à 37 °C, 5 % de dioxyde de carbone (CO₂) pendant une nuit pendant 16-22 h.

3. Jour 2 - Infection des cellules

1. Retirez la ou les plaques de l’incubateur et utilisez un microscope optique pour confirmer que les cellules sont uniformément dispersées dans les puits et que la confluence est de ~50 %. Si les cellules ne se trouvent pas dans une plage de 45 % à 55 % de confluence, répétez le protocole du « jour 1 » et ajustez la concentration cellulaire initiale en conséquence.
2. Générer des dilutions en série des échantillons de sérum d’intérêt dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL en utilisant du DMEM complet préchauffé comme diluant. Le tableau 1 montre la génération d’une cascade de dilution pour des échantillons en trois exemplaires.
   1. Pour effectuer le test en trois exemplaires, préparer une solution mère de 7,5 x 10⁶ génomes de vecteurs (vg)/μL de solution de travail d’AAV6-hPLAP (voir la table des matériaux) en diluant une solution mère de virus dans 1x PBS.
   2. Ajouter 66 μL de la solution de travail du virus 7,5 x 10⁶ vg/μL dans chaque tube contenant 264 μL de dilution sérum/milieu (330 μL de volume total/dilution, voir le tableau 1).
      note: Il s’agit d’un test robuste qui ne nécessite pas de conditions de culture parfaites. Cependant, pour quantifier avec précision et s’assurer que chaque essai est fiable, il est nécessaire d’inclure les éléments suivants : (1) un témoin de virus et de milieux seulement, (2) un témoin de milieux seulement, et (3) un échantillon de témoin NAb positif sur toutes les plaques dans les mêmes conditions expérimentales. Le volume décrit (330 μL) représente trois échantillons + 10 % du mélange sérum et virus. Il est fortement recommandé d’effectuer des répétitions pour déterminer avec précision l’activité neutralisante.
3. Mélanger les dilutions virus/sérum par pipetage et placer les tubes contenant les mélanges virus/sérum dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 30 min pour permettre une neutralisation potentielle.
4. Pipeter 100 μL du mélange virus/sérum dans chaque puits de la plaque à 96 puits contenant 1 x 10⁴ cellules/puits pour chaque dilution.
   note: Cela générera une concentration virale finale de 15k virus/multiplicité cellulaire d’infection (MOI) dans chaque puits. Le tableau 2 fournit un exemple de disposition de plaque d’échantillonnage à 96 puits pour évaluer les échantillons à une dilution de 1/512.
5. Enveloppez la plaque à 96 puits contenant les cellules, le sérum et l’AAV-hPLAP dans une feuille d’aluminium et placez-la dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant une nuit pendant 16 à 24 h pour permettre à l’AAV d’entrer dans les cellules.

4. Jour 3 - Fixation et ajout de substrat aux cellules

1. Préchauffer une aliquote de 1x PBS à 37 °C (~25 mL/plaque à 96 puits). Refroidir séparément des aliquotes de PBS (~25 mL/plaque à 96 puits) et de H₂O doublement distillé (DDW, ~25 mL/plaque à 96 puits) à 4 °C. Dissoudre une pastille de BCIP/NBT (voir le tableau des matériaux) dans 10 mL de DDW dans un tube à centrifuger conique de 50 mL par vortex (10 mL suffisent pour 2 plaques à 96 puits).
2. Aspirer le fluide des puits de la plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette sérologique ou similaire fixée à un système d’aspiration par aspiration ou à un aspirateur de hotte. Placez délicatement l’extrémité de la pipette sérologique dans le puits et retirez le milieu en prenant soin de ne pas perturber les cellules collées.
   1. Ajouter 50 μL de RT 4 % PFA dans chaque puits à l’aide d’une pipette. Enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium et laissez-la à RT pendant 10 min pour fixer les cellules.
      prudence: Le paraformaldéhyde (PFA) est un cancérogène probable et est toxique par contact avec la peau, les yeux ou l’inhalation. Manipulez une hotte avec un équipement de protection individuelle approprié ainsi qu’un masque facial. Préparez du PFA frais à 4 % dilué dans du PBS (~7 mL requis par plaque à 96 puits).
3. Laver et aspirer les cellules avec 200 μL de RT 1x PBS. Répétez cette étape deux fois.
   note: Une pipette multicanaux est une option efficace pour les étapes de pipetage.
4. Pipeter 200 μL de PBS préchauffé dans chaque puits, envelopper la plaque dans du papier d’aluminium et incuber à 65 °C pendant 90 minutes pour dénaturer l’activité de la phosphatase alcaline endogène.
5. Aspirer les puits et les cellules de lavage avec 200 μL de PBS froid (4 °C). Aspirez à nouveau, lavez dans 200 μl de DDW froid et aspirez à nouveau.
6. Pipeter 50 μL de BCIP/NBT dissous (préparé à l’étape 4.1) dans chaque puits.
7. Enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium et incubez à RT pendant 2 à 24 h
   note: Être cohérent avec le temps d’incubation entre les cycles ; La flexibilité du temps permet aux utilisateurs de photographier les puits soit le jour 3, soit le lendemain.
8. À l’aide d’une caméra de microscope optique, prenez des photos de chaque puits à l’aide d’un objectif 4x, en veillant à ce que la même exposition, l’équilibre des blancs et les paramètres de lumière soient utilisés de manière cohérente pour tous les tests effectués.
   1. Positionnez chaque puits de manière identique et assurez-vous que les bords du puits ne sont pas visibles sur les photos. Enregistrez les photos au format TIF ou similaire.
      note: Les réglages spécifiques varient d’un microscope à l’autre, mais la quantification sera plus efficace si l’éclairage de fond est élevé et constant dans tous les puits (figure 1B).

Tableau 1 : Volumes de sérum et de diluant nécessaires pour générer des dilutions en série de sérum en trois exemplaires.

Étiquette en cascade de dilution	dilution	3 x échantillon (240 μL) + 10 % de volume tampon (24 μL)	Rapport sérum :milieu
Dilution 1 (D1)	1/2	264 μL de sérum 264 μL de milieu	50:50
Dilution 2 (D2)	1/4	Média 264 μL D1 + 264 μL	25:75
Dilution 3 (D3)	1/8	Supports 264 μL D2 + 264 μL	12.5:87.5
Dilution 4 (D4)	1/16	Média 264 μL D3 + 264 μL	6.25:93.75
Dilution 5 (D5)	1/32	Média 264 μL D4 +264 μL	3.13:96.87
Dilution 6 (D6)	1/64	Média 264 μL D5 + 264 μL	1.56:98.44
Dilution 7 (D7)	1/128	Média 264 μL D5 + 264 μL	0,78:99,22
Dilution 8 (D8)	1/256	Média 264 μL D5 + 264 μL	0,39 à 99,61
Dilution 9 (D9)	1/512	Média 264 μL D7 + 264 μL	0.2:99.8
Dilution 10 (D10)	1/2048	Média 132 μL D8 + 396 μL	0,05 à 99,95
Dilution 11 (D11)	1/8192	Média 132 μL D9 + 396 μL	0,01 à 99,99
Dilution 12 (D12)	1/32768	Média 132 μL D10 + 396 μL	0.003:99.997

Tableau 2 : Exemple de disposition de plaque à 96 puits pour évaluer des échantillons de sérum naïfs dans des dilutions allant de 1/2 à 1/512. Des dilutions plus élevées sont incorporées dans l’essai si l’on évalue un échantillon connu pour être positif pour les NAbs AAV (échantillons post-administration) ou si un titre plus élevé est requis. MO (-C) : contrôle multimédia uniquement. VO (+C) : contrôle des virus et des supports uniquement. mAb : Anticorps monoclonal contre l’AAV (contrôle NAb positif).

Échantillon de sérum #1

Échantillon de sérum #2

Échantillon de sérum #3

Mono AB (mAB), commandes et échantillons supplémentaires

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

50 ng Mab

50 ng Mab

50 ng Mab

B

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

5 ng Mab

5 ng Mab

5 ng Mab

C

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

0.5 ng Mab

0.5 ng Mab

0.5 ng Mab

D

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

MO (-C)

MO (-C)

MO (-C)

E

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

VO (+C)

VO (+C)

VO (+C)

F

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

Sample #1 1/512

Sample #1 1/512

Sample #1 1/512

G

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

Sample #2 1/512

Sample #2 1/512

Sample #2 1/512

H

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

Sample #3 1/512

Sample #3 1/512

Sample >#3 1/512

Résultats

Figure 1 : Schéma de principe du protocole de test NAb. (A) Représentation visuelle du test NAb illustrant les principales étapes du protocole de trois jours. En bref, les cellules sont cultivées et mises en boîte pendant la nuit. Le lendemain, des dilutions en série de sérum sont préparées, incubées avec de l’AAV, puis incubées avec les cellules pendant la nuit. Le lendemain, les cellules son...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,05 % Trypsine/EDTA	Gibco	Référence 25300-054
Tube à centrifuger conique de 50 mL	Faucon	Tél. : 14-432-22	Ou équivalent
75 cm2 flacons carrés	Faucon	353136	Ou équivalent
Plaque à fond plat bien 96 puits	Faucon	353072
Vecteur AAV6-CMV-hPLAP			Muscle Research & Therapeutics Lab (Université de Melbourne, Australie) AAV6-CMV-hPLAP peut être fourni sur demande.
Aluminium
Anticorps monoclonal de souris anti-AAV6 (particule intacte), (ADK6)	PROGEN	610159	Anticorps monoclonal de contrôle positif
PICB/NBT	SIGMAFAST	Réf. B5655
Enceinte de sécurité pour la culture cellulaire et tissulaire
Pipette électronique			Inserts à rayures de 5 et 10 mL
Sérum fœtal bovin	Gibco	Référence 10099-141
Hémocytomètre
Teneur élevée en glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965118
Cellules HT1080	ATCC
incubateur			37 °C, 5 % CO2
Microscope optique avec caméra			Capable de prendre des photos avec un objectif 4x
four			Pour une incubation à 65 °C
paraformaldéhyde	Merck	Référence 30525-89-4
Bain-marie
Pénicilline Streptomycine	Gibco	Référence 15140-122