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1. Préparation du milieu de croissance, de la solution d’ofloxacine et des stocks de cellules E. coli
- Milieu Luria-Bertani régulier (LB) : Ajouter 10 g/L de tryptone, 10 g/L de chlorure de sodium (NaCl) et 5 g/L d’extrait de levure dans de l’eau désionisée (DI). Stérilisez le milieu par autoclavage.
- Plaques de gélose LB : Ajouter 10 g/L de tryptone, 10 g/L de NaCl, 5 g/L d’extrait de levure et 15 g/L de gélose dans de l’eau DI et stériliser le milieu par autoclavage. À la température désirée (~55 °C), verser ~30 mL de milieu gélosé dans des plaques carrées (10 x 10 cm). Séchez les plaques et conservez-les à 4 °C.
- Milieu LB modifié : Ajouter 10 g/L de tryptone et 5 g/L d’extrait de levure dans de l’eau DI. Stérilisez le milieu par autoclavage.
- Milieu LB modifié comprenant un osmolyte : Mélanger 2 milieux LB modifiés avec une solution osmolyte 2 fois en volumes égaux. Pour préparer 2 milieux LB modifiés, ajoutez 20 g/L de tryptone et 10 g/L d’extrait de levure dans de l’eau DI et stérilisez à l’autoclave. Pour préparer la solution d’osmolyte 2x, dissolvez l’osmolyte d’intérêt (quantité 2x) dans de l’eau DI, puis filtrez et stérilisez la solution.
note: L’osmolyte d’intérêt et ses concentrations peuvent être déterminées à partir des tests de criblage de microréseaux de phénotype (voir Protocole 4). Cependant, l’osmolyte testé et la concentration 2x associée peuvent être ajustés en fonction de la nature de la recherche. Par exemple, pour étudier l’impact de 1 mM de chlorure de sodium, une solution d’osmolyte 2x serait une solution de chlorure de sodium de 2 mM.
- Solution mère d’ofloxacine (5 mg/mL) : Ajouter 5 mg de sel d’ofloxacine (OFX) dans 1 mL d’eau DI. Ajouter 10 μL d’hydroxyde de sodium 10 M pour augmenter la solubilité de l’OFX dans l’eau, puis filtrer et stériliser la solution. Préparer les aliquotes et les conserver à -20 °C
note: L’ofloxacine est un antibiotique quinolone qui a été largement utilisé pour les cellules bactériennes en croissance et non en croissance14,21. La concentration minimale inhibitrice (CMI) d’OFX pour les cellules d’E. coli MG1655 se situe dans la plage de 0,039 à 0,078 μg/mL. Notez également que d’autres antibiotiques tels que l’ampicilline et la kanamycine sont couramment utilisés dans la recherche sur la persistance. Le choix des antibiotiques dépend de la nature de l’étude.
- Souches cellulaires d’E. coli MG1655 : Inoculer 2 mL de milieu LB régulier avec une seule colonie dans un tube à essai de 14 mL (à capuchon enclenchable) et cultiver les cellules dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C. Lorsque les cellules atteignent la phase stationnaire, mélanger 500 μL de culture cellulaire avec 500 μL de glycérol à 50 % (stérile) dans un flacon cryogénique et conserver à -80 °C.
2. Propagation des cellules pour éliminer les persistants préexistants
- Pour préparer une culture de nuit, grattez une petite quantité de cellules d’un stock de cellules congelées à l’aide d’une pointe de pipette stérile (ne décongelez pas le stock de cellules de glycérol) et inoculez les cellules dans 2 mL de milieu LB modifié dans un tube à essai de 14 mL à capuchon encliquetable. Cultivez les cellules dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C pendant 12 h.
- Première propagation
- Après 12 h, transvaser 250 μL de culture pendant la nuit dans 25 mL de milieu frais modifié dans une fiole défrichée de 250 mL recouverte d’une feuille d’aluminium stérile.
- Cultivez la culture cellulaire dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C jusqu’à ce que les cellules atteignent la phase exponentielle médiane (OD600 = 0,5).
- Mesurez la densité optique à 600 nm (OD600) à l’aide d’un lecteur de microplaques toutes les 30 min.
- Deuxième propagation
- À une DOde 600 = 0,5, diluer 250 μL de culture cellulaire du premier flacon dans 25 mL de milieu LB frais modifié dans un flacon à chicanes de 250 mL.
- Cultivez la deuxième culture cellulaire dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C jusqu’àOD 600=0,5.
- Mesurez la densité optique toutes les 30 min.
note: Une culture nocturne peut avoir une quantité importante de cellules persistantes. La méthode du cycle de dilution/croissance décrite ci-dessus peut être utilisée pour éliminer ces persistants préexistants avant de transférer les cellules dans des microréseaux. Leur élimination peut être validée en quantifiant les niveaux persistants de cultures nocturnes à l’aide de l’essai décrit dans le protocole 3.
3. Validation de l’élimination des cellules persistantes préexistantes
- Après la deuxième propagation (voir étape 2.3), diluer 250 μL de culture cellulaire (DO600 = 0,5) dans 25 mL de milieu LB frais modifié dans une fiole à chicanes de 250 mL><.
note: Pour les témoins, diluer 250 μL de culture de nuit (voir l’étape 2.1) dans 25 mL de milieu frais modifié dans une fiole chicanée de 250 mL. Avant de transférer les cellules dans le flacon, la densité cellulaire de la culture de nuit doit être ajustée dans un milieu LB fraîchement modifié pour obtenir une DO600 = 0,5.
- Ajouter 25 μL de solution mère d’OFX (5 mg/mL) dans la suspension cellulaire et agiter doucement le ballon pour rendre la culture d’essai homogène. La concentration finale d’OFX est de 5 μg/mL dans la culture d’essai.
- Incuber la culture d’essai dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 °C.
- À toutes les heures du traitement (y compris 0 h, le moment écoulé avant l’ajout d’OFX dans la culture d’essai), transférez 1 mL de la culture d’essai du ballon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
- Centrifuger la culture d’essai dans le tube de microcentrifugation à 17 000 x g pendant 3 min.
- Retirez avec précaution 950 μL de surnageant sans déranger la pastille cellulaire.
- Ajouter 950 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le tube de la microcentrifugeuse.
- Répétez les étapes de lavage 3,5 à 3,7 fois au total jusqu’à ce que la concentration d’antibiotiques soit inférieure à la concentration minimale inhibitrice (CMI).
- Après le lavage final, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de solution PBS, ce qui permet d’obtenir un échantillon concentré 10x.
- Prélever 10 μL de suspension cellulaire et les diluer en série six fois dans 90 μL de solution PBS à l’aide d’une plaque inférieure ronde à 96 puits.
- Repérer 10 μL de suspensions cellulaires diluées sur des plaques de gélose fraîche sans antibiotiques. Pour augmenter la limite de détection, déposer les 90 μL restants de suspension cellulaire sur une plaque de gélose fraîche.
- Incuber les plaques de gélose à 37 °C pendant 16 h, puis compter les unités formant colonies (UFC). Tenir compte des taux de dilution dans le calcul du nombre total d’UFC dans 1 mL de culture d’essai. Les courbes de destruction sont générées en traçant les valeurs logarithmiques des UFC par rapport à la durée du traitement antibiotique.
note: Un traitement OFX de 6 h est suffisant pour obtenir une courbe de destruction biphasique pour les cellules E. coli. Le niveau persistant des cellules multipliées (mesuré par le nombre d’UFC à 6 h) devrait être significativement inférieur à celui de la culture de nuit. Les procédures décrites dans les protocoles 2 et 3 peuvent être exécutées avec des LB réguliers selon la conception de la recherche.
4. Criblages de plaques de microréseaux
- Préparation de cultures de cellules de microréseaux
- Transférez 250 μL de cellules en phase exponentielle dans 25 mL de milieu LB modifié frais dans un tube à centrifuger de 50 mL. Mélangez délicatement la suspension cellulaire pour la rendre homogène.
note: Les cellules en phase exponentielle (OD600 = 0,5) sont obtenues à partir de la deuxième étape de propagation (voir étape 2.3).
- Transvasez la suspension cellulaire diluée dans un réservoir stérile de 50 ml.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 150 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une puce à ADN, c’est-à-dire une plaque à 96 puits contenant divers osmolytes.
note: Les puits qui n’ont pas d’osmolytes servent de témoins.
- Recouvrez la micropuce d’une membrane d’étanchéité perméable aux gaz.
- Incuber la plaque dans un agitateur orbital à 37 °C et 250 tr/min pendant 24 h
note: Dans ces expériences, des plaques disponibles dans le commerce ont été utilisées, telles que des microréseaux de phénotype (PM-9 et PM-10) qui comprennent une large gamme d’osmolytes, de tampons de pH et d’autres produits chimiques à l’état sec à diverses concentrations. Ces microréseaux sont en format de plaque à 96 puits d’une demi-surface. Les volumes de culture doivent être ajustés en fonction du type de plaques utilisées. Les microréseaux peuvent également être générés manuellement.
- Préparation manuelle des plaques de microréseaux
- Transvaser 75 μL de solutions d’osmolyte 2x dans les puits d’une plaque d’une demi-surface de 96 puits.
- Transférez 500 μL de cellules en phase exponentielle dans 25 mL de milieu 2x LB modifié dans un tube à centrifuger de 50 mL. Mélangez délicatement la suspension cellulaire pour la rendre homogène.
note: Le taux d’inoculation a été ajusté pour être conforme au protocole de dépistage des microréseaux décrit à la section 4.1.
- Ajouter 75 μL de suspension cellulaire dans chaque puits de la demi-surface de la plaque à 96 puits contenant 2 solutions d’osmolyte.
- Incuber la plaque dans un agitateur orbital à 37 °C et 250 tr/min pendant 24 h.
- Préparation des plaques d’essai persistantes
- Préparez 25 mL de milieu LB modifié contenant 5 μg/mL d’OFX dans un tube à centrifuger de 50 mL et transférez ce milieu dans un réservoir stérile.
- Transférer 190 μL de milieu LB modifié avec OFX du réservoir dans chaque puits d’une plaque générique à fond plat de 96 puits (plaque d’essai persistante) à l’aide d’une pipette multicanaux.
- Retirer la micropuce de l’agitateur (après une période de culture de 24 h) et transférer 10 μL de cultures cellulaires de la micropuce dans les puits de la plaque d’essai persistante, contenant du milieu LB modifié avec de l’OFX.
- Prélever 10 μL de suspensions cellulaires à partir de la plaque de dosage persistant et diluer en série trois fois dans 290 μL de solution PBS à l’aide d’une plaque à fond rond à 96 puits et d’une pipette multicanaux.
- Après la dilution en série, prélever 10 μL de toutes les suspensions cellulaires diluées en série sur des plaques de gélose fraîche sans antibiotiques à l’aide d’une pipette multicanaux.
- Incuber la plaque de persistance (préparée à l’étape 4.3.3) dans un agitateur orbital à 37 °C et 250 tr/min pendant 6 h après avoir recouvert la plaque d’une membrane d’étanchéité perméable aux gaz.
- Après 6 h d’incubation dans un agitateur, retirer la plaque de persistance et répéter les étapes 4.3.4 à 4.3.5.
- Incuber les plaques de gélose pendant 16 h à 37 °C, puis compter les UFC. Les niveaux d’UFC avant et 6 h après le traitement antibiotique permettent de calculer la fraction persistante dans chaque puits. Le nombre d’UFC avant le traitement par OFX permet également d’évaluer les effets des osmolytes et sur la viabilité d’E. coli.